二硝基咪唑类化合物在蛋白质修饰中的应用

作     者：陶友琦 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王欢

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 071007[理学-遗传学] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：蛋白质修饰 化学选择性 1,4-二硝基咪唑 酪氨酸硝基化 α-突触核蛋白 

摘      要：蛋白质的翻译后修饰赋予其丰富的性质和功能,而通过天然蛋白质的选择性化学修饰则可人为地赋予其新的功能。尽管化学家已开发了多种修饰策略,但对蛋白质高效地、位点特异性地化学修饰仍是个富有挑战性的课题。1,4-二硝基咪唑及其衍生物在pH 4.0-7.4的水溶液中通过cine-substitution机理选择性地与半胱氨酸侧链巯基反应,而不与赖氨酸侧链ε-氨基以及其他常见亲核基团反应,具有高化学选择性。我们将这一反应用于蛋白质高效地、半胱氨酸选择性的化学修饰。通过连接有炔基的1,4-二硝基咪唑衍生物在BSA的特定半胱氨酸位点修饰上炔基,带有该标签的蛋白质可进一步通过Cu催化的叠氮-炔基1,3-偶极环加成反应方便地连接多种功能分子,如荧光团等。连接有荧光团、多肽的1,4-二硝基咪唑衍生物,可在SrtA的半胱氨酸位点连接上相应功能分子,修饰效率可达近完全转化。连接有生物素的1,4-二硝基咪唑衍生物则可用于复杂样品如细胞裂解液蛋白质组中半胱氨酸残基的标记,从而可将带有标签的蛋白质通过链霉亲和素pull-down的方式富集,有望用于化学蛋白质组学的研究。1,4-二硝基咪唑及其衍生物与赖氨酸侧链ε-氨基的反应在pH 8.0及以上的碱性水溶液中也可发生,采取与巯基截然不同的“ring-opening&ring-close机理,在无还原态巯基存在时,对于赖氨酸侧链ε-氨基有高选择性,而不与其他常见亲核基团反应。该反应速率较慢,但我们发现在反应体系中加入NaHCO3可加快反应速率,且速率加快与NaHCO3浓度呈正相关,展现出特殊的“盐效应。利用此现象,1,4-二硝基咪唑衍生物在无还原态半胱氨酸残基存在时,可用于化学选择性修饰蛋白质的赖氨酸残基。另外,该分子还可用于修饰含伯胺磷脂,有望用于革兰氏阳性细菌质膜的选择性标记。5-甲基-1,4-二硝基咪唑在365 nm的紫外光照射下可选择性地硝基化酪氨酸,得到3-硝基-酪氨酸产物,我们推测该反应通过自由基机理发生。反应对酪氨酸侧链具有高选择性,在水溶液中1 h可达近定量转化。该反应可作为一种高效地、可控的、温和的硝基化蛋白质的新方法。我们通过此方法可将α-突触核蛋白的4个酪氨酸残基全部硝基化,并探究了这一天然存在的翻译后修饰对于其结构以及形成amyloid的倾向的影响。1,4-二硝基咪唑及其衍生物拥有3种不同的模式针对蛋白质的不同残基选择性地修饰,为蛋白质相关的研究提供了新的化学生物学工具。