丙戊酸钠对iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞的炎性反应的影响及其调控机制

作     者：高倩云 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈向真

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：乳腺炎 iE-DAP 丙戊酸钠 牛乳腺上皮细胞 炎性反应 

摘      要：奶牛乳腺炎是困扰牧场的一大难题,不仅严重影响着奶牛的健康和生产,给牧场带来巨大的经济损失,劣质的奶产品也危害着消费者的健康。固有免疫是机体的第一道防线,病原体侵入上皮细胞和内皮细胞,并在乳腺组织中定殖造成乳腺损伤,引起免疫应答,以及更为严重的感染和炎性反应。引起乳腺感染的革兰氏阴性细菌,都可以产生大量的γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP),与胞内受体NOD1结合,激活下游的NF-κB和MAPK信号通路,调控炎症相关基因的表达,引发乳腺的炎性反应。作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,丙戊酸钠在临床上普遍用于治疗癫痫、双相情感障碍、偏头痛等疾病。近年来研究表明,丙戊酸钠在体内体外都发挥着抗炎作用,能通过调控NF-κB和MAPK信号通路缓解炎性反应,并能调节细胞凋亡和自噬来防御病原体、保护机体。本试验通过对武汉某牧场患有乳腺炎的奶牛的奶样进行高通量测序,分析主要的细菌类型。用革兰氏阴性菌细胞壁的成分iE-DAP,刺激牛乳腺上皮细胞诱导炎性反应,并添加丙戊酸钠预处理来探究其对iE-DAP引起的牛乳腺上皮细胞的炎性反应的影响及其调控机制。1 16S rRNA高通量测序检测患乳腺炎奶牛的奶样中菌群的组成及多样性奶牛乳腺炎主要由病原微生物诱发,危害奶牛健康与生产,给养殖场带来经济损失。本试验旨在通过分析采集的患乳腺炎奶牛的奶样,了解患病奶牛的奶样菌群的组成及多样性。本试验选择武汉某牧场40头患乳腺炎的奶牛,采集奶样、提取细菌DNA,扩增并纯化后,通过16S rRNA高通量测序技术进行测序,从Alpha多样性和不同分类水平下菌群组成等方面,对测序结果进行分析。结果显示:奶样中细菌在97%的一致水平下,得到OTU的总个数为12954。在门水平上,对奶样中菌落进行分析,发现变形菌门、放线菌门和厚壁菌门为主要菌群;在科水平上分析奶样菌落组成,发现莫拉氏菌科、肠杆菌科和黄单胞菌科为主要菌群;在属水平上分析,发现变不动杆菌属、克雷伯菌属和寡养单胞菌属为主要的优势菌群。本研究表明,患乳腺炎奶牛奶样中的细菌多样性分布较广,细菌丰度较高,而革兰氏阴性菌是主要的致病菌,为牛场乳腺炎的防控和研究提供了指导意见。2 丙戊酸钠对iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞炎性反应的影响已有研究表明丙戊酸钠(VPA)在体内体外都能够抑制炎性反应。本试验旨在探讨丙戊酸钠是否能调节由γ-D-谷氨酰胺-内消旋-二氨基庚二酸(正-DAP)刺激引起的牛乳腺上皮细胞(BMECs)的炎性反应。通过检测IL-6、IL8和HDAC3基因的表达,优化iE-DAP和VPA的处理浓度和作用时间。将牛乳腺上皮细胞在完全培养基中培养,分为四组处理:用完全培养基培养的CON组、用10 μg/mL浓度的iE-DAP处理6 h的DAP组、用0.5 mmol/L浓度的丙戊酸钠处理6 h的VPA组和先用0.5 mmol/L浓度的丙戊酸钠预处理6 h、接着换成10μg/mL浓度的iE-DAP处理6 h的VD组。经不同处理后收集细胞上清液或细胞裂解液,用于基因和蛋白的检测。结果显示,VPA可以抑制细胞上清液中iE-DAP刺激引起的IL-6和TNF-α含量的升高,并上调抗炎因子IL-10的浓度;检测炎症相关基因显示,iE-DAP刺激可以上调促炎因子IL-6、IL-8和IL-1β与抗菌肽LAP的基因表达量,而VPA预处理可以下调促炎因子IL-6、牛β-防御素(BNBD5)和急性期蛋白SAA3基因的基因表达量;DAP组凋亡相关基因Bax和caspase-3的表达量显著高于CON组,而VPA预处理可以降低Bax、caspase-3和caspase-9的表达量。此外,VD组LC3B-II的蛋白表达量显著高于DAP组,p62的蛋白表达量显著低于DAP组。本试验表明,丙戊酸钠可以降低炎症相关基因的表达水平,减少细胞的凋亡,促进细胞自噬反应,减少iE-DAP刺激引起的牛乳腺上皮细胞的炎性反应,进而保护细胞。3 丙戊酸钠对iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞炎性反应的调控机制作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制剂,丙戊酸钠在炎性反应的调控中,发挥一定的作用。本试验旨在探讨丙戊酸钠在iE-DAP刺激的牛乳腺上皮细胞中,抑制炎性反应的潜在调节机制。将牛乳腺上皮细胞在完全培养基中培养,分为四组处理:对照组(CON)、iE-DAP组(DAP)、丙戊酸钠组(VPA)和丙戊酸钠+iE-DAP组(VD)。经不同处理后收集细胞上清液或细胞裂解液,用于基因和蛋白的检测。结果显示,与对照组(CON)相比,DAP组NOD1、RIPK2、NF-κB和IκB的mRNA表达量显著上升,NOD1、RIPK2、磷酸化的p65和p-IκB蛋白的表达量上升。然而VPA预处理可以抑制NOD1/NF-κB通路的激活,下调相关基因和蛋白的表达量。类似地,DAP组p38、E