小麦miR167e的特征及表达分析

作     者：常亚南 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李永春

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦 miR167e 基因克隆 表达分析 STTM BSMV 

摘      要：小麦籽粒发育过程的调控直接影响到小麦的千粒重和产量,探讨小麦籽粒发育的分子调控机制对于开展小麦高产育种具有重要的意义。在前期研究中,系统分析了籽粒发育过程中差异表达的miRNA,发现miR167在籽粒发育过程中上调表达。在此基础上,本研究鉴定了小麦miR167家族新成员tae-miR167e,并分析了其序列特征、靶基因特征、时空表达模式,初步探讨了该miRNA在籽粒发育过程中的调控功能。主要研究结果如下:1.以中国春、豫麦18和矮抗58为材料,通过RT-PCR技术,克隆了小麦MIR167e的三个部分同源基因片段并分析了其序列特征。小麦MIR167e基因定位在第5染色体群的短臂上,将该基因A、B和D基因组的三个部分同源基因分别命名为TaMIR167e-5AS、TaMIR167e-5BS和TaMIR167e-5DS。序列分析显示,该基因在3个品种间克隆区域存在SNP和In Del差异,而在转录起始位点下游的RNA折叠区域则高度保守且在成熟tae-miR167e对应区域完全一致。通过RNA折叠分析显示,3个部分同源基因均能形成特定的发夹结构。利用生物信息学分析方法对tae-miR167e靶基因进行了预测分析,结果显示共预测出80个靶基因,利用NCBI对这些靶基因进行序列分析,结果显示有32个靶基因序列在中国春的数据库中是注释完整的。其余靶基因的序列是未知的。并对其中一个靶基因Ta PHT4;3进行了详细的蛋白特征分析和基因家族的聚类分析。2.籽粒发育过程中tae-miR167e的表达分析显示,该miRNA在所检测6个品种中均表现为随着灌浆进程其表达水平逐渐上调的趋势,其中一个靶基因Ta PHT4;3的表达趋势与miR167e的表达模式相反,在6个品种的籽粒发育过程中呈下调表达的趋势。不同组织中的表达特性分析显示,tae-miR167e在叶片和根系中表达量较高,穗下节中表达量较低。整体来看,靶基因Ta PHT4;3在不同组织中的表达水平均较低。在干旱胁迫条件下,该miRNA受胁迫诱导而上调表达,与中国春小麦相比,矮抗58小麦根系中该miRNA的诱导表达启动更快,在叶片中的表达水平更高;在盐胁迫条件下,该miRNA在根系中呈下调表达趋势,而在叶片中受胁迫诱导而上调表达。由此推测,tae-miR167e在小麦发育调控和渗透胁迫响应过程中发挥重要功能。3.为了探讨tae-miR167e的生物学功能,构建了基于STTM的miR167e抑制表达载体,并通过大麦条纹花叶病毒（BSMV）介导的STTM技术分析了miR167e抑制表达后对籽粒发育的影响。结果显示,在叶片中利用该技术可以有效抑制内源miR167e的表达;在开花后5天进行穗部接种显著抑制了miR167e的表达,并导致小麦籽粒的发育特性发生明显的改变,千粒重增加了3%。上述研究结果表明miR167e在籽粒发育过程和逆境胁迫响应过程中发挥重要的调控功能,相关的调控机制仍有待于进一步深入研究。