miR-340-5p靶向ATF7基因调节绵羊肌内前体脂肪细胞分化的研究
作者单位：山西农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘文忠
授予年度：2020年
主 题：绵羊 miR-340-5p ATF7 肌内脂肪 细胞分化
摘 要：MicroRNAs(miRNAs)是短链非编码RNA,可以通过碱基互补配对的方式结合到靶基因m RNA的3’UTR、5’UTR和CDS区,促进靶基因m RNA降解或抑制其蛋白翻译。miRNA在许多生命过程中发挥重要的调节作用,如前体脂肪细胞的分化、脂质代谢和脂质积累等生理过程。但目前的研究主要集中于miRNA对模式动物脂肪细胞分化的调控,关于它们参与绵羊肌内前体脂肪细胞分化的研究较少。ATF7(activating transcription factor 7)是ATF转录因子家族的成员之一,通过结合到靶基因增强子区,抑制转录的起始过程。目前已知ATF7可以促进脂肪细胞分化,但具体机制尚不清楚。研究miRNA和ATF7在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的功能和分子机制,对提高绵羊胴体的肉质品质、改善脂肪细胞分布奠定理论基础。本试验旨在研究miR-340-5p和靶基因ATF7对绵羊肌内前体脂肪细胞分化的影响机制。用胶原酶消化法,在体外得到绵羊肌内前体脂肪细胞,并用油红O染色、q RT-PCR和Western Blotting在细胞分化不同时段检测细胞的成脂分化能力。分析实验室前期miRNA组测序数据,得到表达量较高且差异的miR-340-5p。用双荧光素酶报告检测系统,检测miR-340-5p与ATF7之间是否具有靶标关系。用转染miR-340-5p mimics和inhibitors的方法,过表达和抑制miR-340-5p,在细胞水平研究miR-340-5p对绵羊肌内前体脂肪细胞的影响。将构建好的ATF7慢病毒过表达载体与慢病毒抑制载体,用慢病毒包装的方法在293T细胞中得到具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染绵羊肌内前体脂肪细胞,过表达或抑制ATF7的表达。用油红O染色、q RT-PCR和Western Blotting方法检测试验中空白对照组与试验组脂滴积累量、成脂相关标志基因的m RNA和蛋白表达量,以研究ATF7转录因子在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的作用机制。本研究的主要结果如下:(1)在体外成功分离培养绵羊肌内前体脂肪细胞。培养3 d的前体脂肪细胞展现出梭形和不规则三角型,没有脂滴出现。在分化培养过程中,分化的脂肪细胞从少变多,脂滴由小变大,成脂标志基因PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ)、C/EBPα(CCAAT enhancer binding proteinα)和FABP4(fatty acid binding protein 4)的m RNA和蛋白表达量,在0、6和12 d呈现逐步上升趋势,表明体外分离培养的细胞可用于后续试验。(2)验证miR-340-5p与ATF7之间的靶标关系。在实验室前期miRNA测序数据中找到差异表达的miR-340-5p,通过生物信息学预测软件发现,miR-340-5p在ATF73’UTR有潜在的结合位点。双荧光素酶报告系统结果显示,miR-340-5p可显著降低含有3’UTR的双荧光报告载体的荧光强度(P0.01),说明miR-340-5p与ATF7之间存在靶标关系。(3)miR-340-5p抑制绵羊肌内前体脂肪细胞的分化。在体外培养的绵羊肌内前体脂肪细胞中过表达miR-340-5p,分化培养12 d,ATF7 m RNA和蛋白表达量与对照组相比显著下降,成脂标志基因的m RNA和蛋白表达量与对照组相比也显著降低。当抑制miR-340-5p表达时,呈现出相反的结果。说明miR-340-5p靶向ATF7抑制绵羊肌内前体脂肪细胞的分化。(4)ATF7促进绵羊肌内前体脂肪细胞分化。通过构建ATF7慢病毒过表达和抑制表达系统,在绵羊肌内前体脂肪细胞中过表达或抑制ATF7的表达。发现,在过表达ATF7后,STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)表达量显著下降(P0.01),PPARγ的表达量显著上升(P0.01),细胞成脂分化能力增强,成脂标志基因m RNA和编码蛋白表达量均不同程度上调,在ATF7抑制后,以上数据均呈现相反的表达趋势。说明ATF7通过抑制STAT1的表达,促进PPARγ的表达,进而促进绵羊肌内前体脂肪细胞的成脂分化。以上结果表明,miR-340-5p靶向ATF7,抑制绵羊肌内前体脂肪细胞的成脂分化。为增加绵羊肌内脂肪含量,提高胴体质量提供科学依据。
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