盐酸高乌甲素诱导HCT-116和HepG2细胞凋亡的分子机制研究

作     者：宋娜 

作者单位：西北师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马君义

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 

主      题：盐酸高乌甲素 人结直肠癌HCT-116细胞 人肝癌HepG2细胞 细胞周期阻滞 细胞凋亡 MAPK信号通路 

摘      要：结直肠癌和肝癌严重威胁着人类的生命和健康,因此迫切需要疗效好且副作用低的抗肿瘤药物。高乌甲素(Lappaconitine,LA)是一种从乌头属植物高乌头根中提取的生物碱,由于其良好的镇痛作用且不具备成瘾性,已在临床应用多年,然而,低溶解度限制了LA的临床应用。为了降低副作用,提高溶解度,增强治疗效果,本研究通过在LA中引入氯离子,成功制备了LA衍生物——盐酸高乌甲素(LH)。研究发现LA及LA衍生物[硫酸高乌甲素(LS)、氢溴酸高乌甲素(LAH)、LH]在多种肿瘤细胞中表现出很好的抗肿瘤活性,但LH的抗肿瘤机理仍不清楚。本文以HCT-116细胞和HepG2细胞为研究对象,细胞增殖通过CCK-8和Ed U增殖法检测;DAPI染色观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布;细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、CytC、P53、Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-7、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)、MAPK通路相关蛋白(ERK1/2、JNK、P38、p-JNK、p-P38、p-ERK1/2)表达水平通过Western blot检测;Rt-PCR检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 m RNA水平;JC-1荧光探针法测定细胞线粒体膜电位(MMP)变化;DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;并构建HCT-116荷瘤裸鼠模型,评估LH在体内对HCT-116荷瘤裸鼠的抑瘤作用;H&E染色观察裸鼠移植瘤、心、肝、脾、肺、肾等组织的病理学变化。从体外和体内两个方面研究LH诱导HCT-116和HepG2细胞凋亡的可能分子机制,为开发新型抗肿瘤药物提供理论基础和实验数据。研究结果如下:(1)LH以剂量和时间依赖的方式抑制HCT-116、HepG2细胞增殖,其抑制效果优于同剂量的LA。LH处理HepG2、HCT-116细胞24 h的IC分别为596.2μg/mL、413.1μg/mL,处理48 h IC分别为371.5μg/mL、174.2μg/mL。(2)LH可诱导HCT-116、HepG2细胞S期周期阻滞和凋亡,随着LH剂量的逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高。(3)HCT-116和HepG2细胞经LH处理后,MMP逐渐降低,细胞内ROS水平逐渐升高。LH可调控CytC、Bcl-2家族(Bax、Bcl-2)、P53、Caspase家族(Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-7、Cleaved caspase-3)蛋白表达,通过线粒体途径诱导HCT-116和HepG2细胞凋亡。(4)HCT-116和HepG2细胞经LH处理后,p-JNK和p-P38的蛋白表达水平升高,而p-ERK1/2表达量降低,ERK1/2、JNK、P38的蛋白表达水平基本保持不变。提示LH可能通过MAPK信号通路诱导HCT-116和HepG2细胞凋亡。(5)LH对HCT-116异种移植裸鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用,但并没有减轻裸鼠体重。LH治疗组和5-FU治疗组相比阴性对照组,肿瘤生长缓慢,且LH抑瘤效果与5-FU相当;LH对裸鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器几乎没有影响;经LH治疗的裸鼠肿瘤组织内Bax、Cleaved caspase-9/3、p-P38的蛋白表达量显著增加,而Bcl-2的蛋白表达量减少,与体外细胞实验结果一致。综上所述,LH可显著抑制HCT-116和HepG2细胞增殖,通过线粒体通路及MAPK信号通路诱导细胞凋亡。LH对HCT-116异种移植裸鼠有明显的抗肿瘤作用,对裸鼠体重和脏器组织几乎没有任何影响,其抑瘤作用与临床用药5-FU相当。