脂肪酸受体CD36通过影响有氧糖酵解促进肝细胞癌进展及相关机制
作者单位：重庆医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈压西
授予年度：2021年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：目的:肝癌,作为一种常见的恶性肿瘤,在我国恶性肿瘤发生率排名中占据前列,同时也是世界范围内因癌症导致死亡的第三大原因。代谢重编程是包括肝癌在内的肿瘤代谢的一个关键特征,它使得肿瘤细胞一方面获得必需的生物大分子用于细胞增殖,一方面还能产生能量以供自身需求。脂肪酸受体CD36是一种整合的跨膜糖蛋白,在各种组织中表达,参与长链脂肪酸的高亲和性摄取。CD36在肝脏的糖代谢和脂肪酸代谢中的重要性已得到证实。然而,CD36在HCC进展过程中的代谢重编程中的作用仍有待进一步阐明。因此,本研究拟探索CD36在肝癌中的表达情况及CD36的表达增加促进肝癌进展的原因,并对其中的代谢调控机制进行了一定的阐释。方法:第一部分:分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的373份HCC病例样本(包括50对正常肝组织)和GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中编号为GSE14520的225份HCC病例样本(包括220对正常肝组织)中CD36的表达情况;用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对30例HCC患者癌与癌旁组织的CD36的mNA表达水平进行检测;使用RT-PCR和Western Blot对正常肝细胞L02细胞系和HCC细胞Huh7、SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMCC-7721以及Hep G2细胞系分别进行CD36的mNA表达水平和蛋白水平进行检测。第二部分:体外实验中,用含有CD36 cDNA的重组慢病毒构建CD36过表达(CD36 OE)的Huh7和SK-Hep-1细胞系,并用Western Blot检测两种细胞系CD36蛋白过表达水平;采用长期动态连续监测培养箱和EdU试验检测CD36 OE细胞或对照细胞的增殖情况;肿瘤细胞用流式细胞仪进行细胞周期检测;使用肿瘤细胞创面愈合实验和transwell实验对CD36过表达后肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变进行评价。第三部分:用Seahorse Xfe-24分析仪测定Huh7和SK-Hep-1两种CD36过表达细胞系的能量代谢表型和比色法测定HCC细胞乳酸含量以测量两种肿瘤细胞糖酵解能力;Western Blot分析Huh7和SK-Hep-1两种CD36过表达细胞系哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,m TOR)及其磷酸化p-m TOR的蛋白表达水平及下游靶点AKT、p-AKT(Ser43位点)蛋白水平;m TOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RA)处理HCC细胞后观察细胞增殖情况;用创面愈合和transwell实验评价RA处理后是否影响HCC细胞的迁移和侵袭能力;糖酵解应激试验测定RA对Huh7和SK-Hep-1细胞糖酵解能力的影响;AKT抑制剂MK-2206处理两种HCC肝癌细胞后,用创面愈合和Transwell实验验证AKT/m TOR信号通路对两种肝癌细胞的迁移和侵袭能力的改变。结果:第一部分:TCGA数据库中肝癌病人HCC组织CD36的mNA表达水平(N=373)显著高于与其配对的正常肝组织CD36的mNA水平(N=50)。同样,来自GEO数据库的病例资料显示CD36在HCC组织中增加。对30对重庆医科大学附属第二医院肝癌患者配对肝癌及癌旁组织CD36的mNA水平检测显示,与对应的非癌组织相比,HCC组织中CD36的mNA水平显著升高。以正常肝细胞L02为对照,检测发现SMCC-7721、Hep G2和PLC/PRF/5肝癌细胞在mNA和蛋白水平上均丰富表达CD36。SK-Hep-1和Huh7肝癌细胞的CD36表达虽然在mNA水平上有几倍的升高,但在蛋白水平上和对照细胞相比没有明显差异。第二部分:体外实验中,构建CD36过表达的Huh7和SK-Hep-1肝癌细胞系后,长时间动态连续监测法、EdU法和细胞周期法分析发现CD36过表达显著促进肿瘤细胞增殖。创面愈合实验和transwell实验表明CD36过表达可以增强肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。第三部分:Seahorse XF分析仪检测两种过表达肝癌细胞系的代谢表型发现:CD36过表达时,HCC细胞倾向于糖酵解途径,且增加了乳酸的产生。糖酵解应激试验显示,CD36过表达可促进糖酵解和糖酵解能力。CD36过表达可诱导m TOR的磷酸化,抑制CD36可有效地抑制m TOR信号。RA预处理后可以抑制肝癌细胞的增殖作用,并消除CD36过表达对肝癌细胞糖酵解和糖酵解能力的影响。CD36过表达可激活AKT的磷酸化。而使用AKT的抑制剂后可阻断m TOR信号,同时抑制CD36过表达诱导的肿瘤细胞增殖和迁移。结论:CD36在HCC中呈高表达,在体内外CD36表达升高有助于肿瘤的生长和转移。代谢表型分析显示CD36过表达的HCC细胞具有更强的糖酵解潜能,而
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