拟南芥COG4与Glo3P型ArfGAP蛋白的互作及其在花粉管生长中的功能研究

作     者：魏娟 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：鲍依群

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：拟南芥 花粉管生长 COG复合体 COG4 ArfGAP 

摘      要：囊泡运输是真核生物细胞内物质运输的一种重要形式,它可以分为囊泡形成、转运、拴系和融合四个步骤。拴系是囊泡与靶膜初步接触并识别的过程,主要由拴系因子来介导。COG复合体（Conserved Oligomeric Golgi complex）是位于高尔基体上的多亚基拴系复合体。在拟南芥中,COG3和COG8亚基在高尔基体形态维持以及花粉管的极性生长中发挥作用。本文对拟南芥COG4与Glo3P型ArfGAP蛋白互作以及在花粉管生长过程中的作用进行了研究,主要结果如下:***4基因的表达和COG4蛋白的定位RT-PCR和GUS染色分析表明COG4基因在花粉中高表达;在烟草表皮细胞中COG4-GFP定位在高尔基体上。***4基因突变导致花粉管生长缺陷cog4/+突变体的遗传分析表明,其雄配子体不育,同时雌配子体遗传信息的传递效率也明显下降。将COG4的全长基因转入cog4/+突变体中,能回补其雄配子体不育,雌配子体半不育的表型,说明cog4/+突变体配子体发育异常是由COG4基因突变所导致。通过扫描电镜（SEM）、亚历山大染色以及DAPI染色的方法观察cog4/+突变体花粉粒外壁的形态、花粉活性以及花粉的核分裂情况,与野生型相比没有显著差异,说明cog4/+花粉的发育正常。cog4/+突变花粉体外萌发正常,但在花粉管生长过程中,60%花粉管呈现出畸形以及爆裂表型。因此,cog4/+突变体的雄配子体不育是由花粉管生长缺陷所导致。***4基因突变导致高尔基体形态异常我们通过荧光观察发现,在野生型花粉中EMP12-GFP标记的高尔基体呈棒状结构,其中有86%花粉的高尔基体长宽比为2.0-3.5,而cog4/+突变花粉中的该比例为18%,这说明在突变花粉中,高尔基体形态结构发生了改变。高压冷冻固定-冷冻替换处理的样品经透射电镜观察发现,在cog4/+突变花粉中高尔基体潴泡（Golgi cisternea）宽度变短,每个潴泡之间的距离变大,高尔基体潴泡失去cis-trans极性。COG4基因突变导致高尔基体形态结构异常。cog4/+突变花粉中COPI囊泡包被蛋白γ-COP-GFP和Arf1家族小G蛋白Arf1c-GFP定位受到影响,弥散在细胞质中。4.拟南芥COG4蛋白与Glo3P型ArfGAP互作为了进一步探究COG4基因的功能,我们以COG4蛋白为诱饵筛选拟南芥酵母双杂交DNA文库,得到了 一个互作蛋白AGD8（ArfGAP domain 8）。拟南芥中AGD8与AGD9和AGD10同源,并与酵母中的Glo3p密切相关,被称为Glo3p型AGD。酵母双杂交,荧光素酶互补成像（LCI）,GST Pull-down实验证明了 COG4蛋白与G1o3P型ArfGAP蛋白互作,双分子荧光互补（BiFC）表明COG4蛋白与Glo3P型ArfGAP蛋白的互作亚细胞位置在高尔基体上。构建pLAT52::AGD8-GFP载体,将其转入cog4/+突变体中,筛选出转基因植株。结果表明cog4突变导致AGD8在细胞质中弥散。本文研究表明拟南芥COG4在花粉管生长及高尔基体形态维持起重要作用,并且COG4蛋白与G1o3P型ArfGAP蛋白在高尔基体上互作。