双水相乳液体系构建载酶碳酸钙微球强化级联酶促反应研究

作     者：陈佳琳 

作者单位：西南交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孟涛

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：双水相乳液 碳酸钙微球 无膜隔室化 匹配纳米孔道 级联酶反应 

摘      要：级联酶反应能避免冗长的中间体纯化分离,节省时间成本资源,为药物合成和药物治疗带来新的可能。如何理性设计多酶系统以实现高稳定性和高活性是一个持续的挑战。本论文构建了mPEG-Urease(甲氧基聚乙二醇-脲酶)颗粒稳定的Dex/PEG乳液,利用双水相乳液对生物大分子的分配,获得了高的酶包封效率(90%)和酶活力保留率(70%);以酶为位点定位矿化碳酸钙,构建具有匹配纳米孔道的隔室化碳酸钙多酶系统,并将两种级联酶顺序固定在不同隔室中,用于级联酶反应的强化及其机理探究。在双水相乳液体系的构建及其反应性能探究部分,利用改性的脲酶构建了稳定的Dex/PEG乳液微反应器。通过荧光显微镜可视化了双水相乳液Dex内相对生物大分子的分配特性;通过改变矿化模板,微环境和矿化时间制备出了分散性好,粒径在9～19μm范围内,且具有3.77 nm纳米通道结构的球形方解石型碳酸钙。这种具有反应性能的双水相乳液系统能为药物载体制备,液滴微反应器和药物输送等领域提供新的思路。在载过氧化氢酶酶碳酸钙部分,作者基于双水相乳液对蛋白质的分配效应和仿生矿化手段,在生成碳酸钙的同时固定了过氧化氢酶。由于双水乳液对蛋白质的富集特性,实现了对过氧化氢酶高达98%的包封率,负载量为24.26 mg·g,酶活保留率为72%;且该固定化酶系统具有低于2%的泄漏率,其热稳定性和表面活性剂耐受性较游离酶分别提升了38.84%(80℃)和44.92%(十二烷基硫酸钠);最后,该固定化酶能在25 min内完全清除纱布漂白后残留的过氧化氢。这种高效碳酸钙固定化酶系统可以为药物运输,生物催化以及日用化学工业提供新的策略。在构建隔室碳酸钙微球及其强化级联酶反应部分,作者通过以酶为位点的两次矿化以及底物浓度的调控,制备了具有匹配纳米孔道的隔室化碳酸钙多酶系统。通过酶活力测定,表明了分区系统催化活性明显优于共混系统(24.8倍,10 min),是目前无机隔室多酶系统领域中分区系统较共混系统强化的最高倍数。这归因于碳酸钙隔室间匹配的纳米孔道,既能实现两种酶的有效分区封装,又降低了底物小分子和中间体在两种酶活性位点间传质的限制。我们期望这种隔室化多酶系统能为药物合成和体内治疗中的级联催化提供一种新的选择。