猪圆环病毒2型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立以及PCV2疫苗对Balb/c小鼠的攻毒保护性研究

作     者：吴佳鑫 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：鲍恩东

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪圆环病毒2型 TaqMan探针 实时荧光定量PCR Balb/c小鼠 免疫攻毒试验 

摘      要：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)会造成猪免疫系统功能障碍,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪圆环病毒相关疾病(PCVD),被认为是全世界家养猪最重要的病原体之一。建立理想的异种动物和本动物模型可以更好地研究病原的生物学特性、致病机理以及检验疫苗保护效力。已有多篇文献表明,在接种PCV2的Balb/c小鼠中可以发现病毒复制、血清转化和微观病变,小鼠动物模型可能对抗病毒试剂和疫苗研究提供极大的便利性。本研究建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,旨在为定量检测PCV2病毒核酸含量提供可靠的工具,并为PCV2相关疾病的研究以及PCV2疫苗的效果评价提供帮助。根据NCBI中猪圆环病毒2型ORF2的保守基因序列设计合成了引物和探针,通过反应条件以及反应体系的优化,成功建立了特异性定量检测PCV2的实时荧光定量PCR检测方法。试验结果证明当样本浓度在1.9×10～1.9×10拷贝/μL时,样本浓度与循环阈值(Cq值)呈现良好的线性关系,相关系数达到0.999。该检测方法灵敏度高,与普通PCR相比敏感性提高1000倍,最低检测浓度为101拷贝/μL,并且本检测方法具有良好的特异性和重复性。本研究建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法与国家标准的qPCR方法检测结果一致,可以作为定量检测PCV2的一种新方法。在建立PCV2 TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的基础上,选取52只SPF级Balb/c小鼠进行PCV2疫苗的小鼠免疫攻毒试验,为PCV2致病性和疫苗评估研究提供试验参考。试验小鼠随机分为3组:阴性空白对照组、PCV2攻毒对照组及灭活疫苗免疫攻毒组。在攻毒后3、7、14、21日,分别选取小鼠,观察其外貌特征、精神状况以及是否有异常病变,然后取心脏、脾脏、肝脏、肺脏及肾脏检测脏器样品的病毒载量。试验结果显示,攻毒对照组小鼠明显较其它两组小鼠消瘦。从攻毒后的第3天即可在小鼠的多个脏器组织中检测出病毒。脏器病毒含量由多至少依次为:肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和心脏。免疫攻毒组的小鼠各脏器组织PCV2病毒载量均较攻毒对照组小鼠有所下降。除肺脏外,其余脏器的病毒载量均呈现出了显著性下降或极显著性下降。试验结果表明Balb/c小鼠可以作为异种动物对PCV2进行免疫攻毒保护研究,并且试验用疫苗可以对小鼠提供一定的保护。