线粒体电子传递链复合体在肌肉分化过程中重新排列

作     者：付玉龙 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王萍萍

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：电子传递链复合体 肌肉分化 重新排列 BN-PAGE Western blot 

摘      要：线粒体是一种具有双层膜结构的半自主性细胞器,参与能量产生、信号转导和氧化还原电位调节等十分重要的生命活动过程。线粒体内膜上的氧化磷酸化系统可以产生ATP,整个系统由电子传递链复合体、电子载体和H+-ATP合酶组成。近期研究结果证明,电子传递链复合体会在一些装配因子的参与下,有组织地形成超级复合体,产生能量,即复合体组织机制的塑性模型,而不是具有高度的运动自由度,即复合体组织机制的随机碰撞模型。塑性模型的正确与否还需通过生理条件变化时,对超级复合体结构、功能和动力学特性的广泛研究来验证。线粒体在机体的分布同细胞细胞类型相关,细胞对能量需求越高,则线粒体越多,如肌肉细胞。研究表明,肌肉分化过程中一些能量相关的转录因子发生明显变化,表明细胞能量水平发生变化,此时,电子传递链复合体也会随之发生变化。本论文以C2C12细胞作为肌肉分化模型,利用BN-PAGE技术检测了C2C12细胞分化过程中线粒体电子传递链复合体的变化,我们的结果表明,同分化前相比,细胞分化2 d、4 d、6 d后,复合体I、III、IV和V均呈现逐渐增加的趋势,证明了分化过程中电子传递链复合体发生了变化。随后进行的Western blot进一步检测了C2C12细胞分化过程中电子传递链每个复合体各个亚基的变化。我们发现,和分化前相比,在我们检测的复合体亚基中,复合体IV和复合体V的亚基同时增加;复合体I和复合体III亚基的表达则出现增加、不变和减少三种情况。BN-PAGE和In-gel activity assays发现超级复合体也发生了变化。这些结果表明在分化过程中各个复合体内部不同的亚基发生变化且程度不完全一致,从另一个角度预示了电子传递链的重新排列。为了模拟电子传递链的重排,我们在C2C12细胞分化过程中通过RNAi分别降低了复合体III和IV中部分亚基的蛋白表达水平。Western blot发现降低复合体IV亚基COX1可以显著地增强细胞的分化;与此相反,降低COX2和COX3的蛋白表达可能会抑制细胞的分化。免疫荧光染色也证明了降低COX1蛋白表达量显著地促进MHC的表达以及肌管的形成,促进细胞的分化。敲低COX8A时,复合体IV的装配受到了影响,使得整个复合体蛋白量随之发生了改变,而其他2个复合体无变化。同时,降低复合体III亚基UQCRQ和UQCR11的表达量对C2C12细胞的分化有一定的影响。除了分化中的肌细胞需要线粒体电子传递链活跃的合成以满足其对能量的需求外,癌组织因为其无限增殖的特性也需要大量的能量。在我们检测的7个肺癌组织中,和正常组织比较,线粒体电子传递链复合体I亚基NDUFS1、复合体II亚基SDHA和SDHB蛋白表达量在癌旁组织或变化或不变,在癌变组织中均发生变化;复合体III亚基CYBB、复合体亚基IV亚基COX5A、复合体V亚基ATP5B蛋白表达量在癌旁组织和癌变组织没有明显变化。同时,我们还在小鼠血液中检测到线粒体电子传递链复合体,猜测可能来自于血液中的免疫细胞。总之,本论文发现了肌肉分化过程中,电子传递链复合体会发生重新排列,调节能量生成,进而影响细胞的分化。