氯吡格雷低反应性冠心病患者血浆及血小板microRNA表达差异的研究

作     者：李济民 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李春坚

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：冠心病 氯吡格雷低反应性 microRNAs 血浆 血小板 

摘      要：目的:探讨氯吡格雷低反应性（Clopidogrel Low Response,CLR）的冠心病（Coronary Artery Disease,CAD）患者血浆及血小板 microRNA（miRNA）表达谱的差异。方法:本研究为一项观察性研究,自2015年4月至2015年8月连续入选78例就诊于南京医科大学第一附属医院经常规氯吡格雷治疗的冠心病患者。入选标准:（1）入院诊断为冠状动脉性心脏病;（3）年龄在18至80岁;（3）常规服用负荷剂量氯吡格雷（300mg）且常规剂量（75mg）至少5天。再应用光学血小板聚集仪（Light Transmittance Aggregometry,LTA）检测5μM二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate,ADP）诱导的血小板聚集率（Platelet Aggregation,PL ADP）。将5μMADP诱导的血小板聚集率（PLADP）46%定义为CLR。选取总样本中PLADP大于上四分位数（PLADP48.5%）的19例CLR患者与PLADP小于下四分位数（PLADP19.5%）的19例氯吡格雷正常反应患者,提取两组患者的血浆miRNA及去白细胞纯化血小板中的总RNA,将两组患者的血浆miRNA样本分别混为两个miRNA池,同样再将去白细胞纯化血小板中的总RNA样本分别混为两个总RNA池。最后再通过高通量测序筛选两组患者血浆及血小板miRNA表达谱的差异。结果:两组患者在年龄、性别、高血压、糖尿病等临床特征和红细胞计数、白细胞计数、尿素氮、谷丙转氨酶等住院期间理化指标上均无统计学意义（P值均0.05）。经免疫磁珠法获取的去白细胞的纯化血小板中提取的总RNA经过变性电泳已检测不出白细胞标志物,而且通过细胞计数显示其白细胞数目/血小板数目接近1/5100000。血浆中提取的miRNA及血小板提取的总RNA通过RNA变性电泳检测未见明显降解,其符合后续miRNA表达谱筛选的质检要求。通过高通量测序发现两组患者在血浆中有48种miRNA存在显著表达差异,其中在差异2倍的显著性下调中拷贝数前20位依次是hsa-miR-122-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-4443、hsa-miR-375、hsa-miR-3158-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-5096、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-92a-3p。有 95 种血小板miRNA表达上存在显著差异,其中在差异2倍的显著性下调中拷贝数前20位依次是 hsa-miR-300、hsa-miR-151b、hsa-miR-1299、hsa-miR-16-1-3p、hsa-miR-3150b-3p、hsa-miR-548am-3p、hsa-miR-1260a、hsa-let-7f-2-3p、hsa-miR-4755-3p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-5004-3p、hsa-miR-6862-5p、hsa-miR-1288-3p、hsa-miR-4661-5p、hsa-miR-4479、hsa-miR-4421、hsa-miR-6788-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-6874-3p、hsa-miR-218-5p。结论:通过免疫磁珠分选法可以获取纯度较高的去白细胞的纯化血小板;与氯吡格雷正常反应组相比,氯吡格雷低反应组在血浆中有hsa-miR-122-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-3p等48种miRNA的表达水平存在显著差异（差异2 倍）,在血小板中有 hsa-miR-300、hsa-miR-151b、hsa-miR-1299 等 95 种miRNA的表达水平存在显著差异（差异2倍）。这些miRNA可能对血小板功能和心血管疾病的发生发展具有一定的调控作用,相关调控网络值得进一步深入研究。