桑椹“大10”和“白玉王”黄酮类化合物差异的代谢组及转录组研究

作     者：李若南 

作者单位：中国计量大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡冲;崔旭红

授予年度：2020年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：桑椹 黄酮类化合物 代谢组 转录组 bHLH转录因子 

摘      要：桑椹是桑属（Morus spp.）植物的果实,不但营养价值高,而且具有多种保健功能,被国家卫生部列入“既是食品又是药品的名单,成为开发功能性食品的优质原料。桑椹资源丰富,以色泽划分主要有红紫色和白色等不同品种,目前国内主栽的是“大10品种,是第一个通过国家审定的桑椹品种,“白玉王等也在生产中得到很好的推广。桑椹品种的品质差异不仅在色泽,还有可溶性糖、有机酸、黄酮类化合物含量等。本研究选取“大10和“白玉王2个桑果品种为材料,利用UPLC-MS/MS和Illumina Hi Seq 4000等技术开展黄酮类化合物组分及生物合成差异研究,主要研究结果:1.代谢组分析“大10与“白玉王桑椹黄酮类化合物差异采用UPLC-MS/MS技术,对“大10和“白玉王成熟期果实的黄酮类化合物进行分析,正负离子模式共鉴定出375种黄酮类化合物,如查尔酮类与二氢查尔酮类化合物26种、黄酮与二氢黄酮类化合物91种、黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物77种、黄烷醇与花色素苷类化合物56种。“大10与“白玉王桑椹黄酮类化合物的含量存在差异。查尔酮与二氢查尔酮类化合物有差异的16种,其中醌式红花苷、柚配基查尔酮、2’-O-甲基臭豆醇和等根皮苷在“大10中含量高于“白玉王,圣草酚查尔酮、去甲基黄腐酚、胡椒碱B等在“大10中含量低于“白玉王。黄酮与二氢黄酮类化合物差异的73种,其中木犀草素、桔皮素、柚皮素等在“大10中含量高于“白玉王,汉黄芩素、圣草酚、杜荆素等在“大10中含量低于“白玉王。黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物有差异的61种,其中山奈酚、槲皮素、二氢槲皮素等在“大10中含量高于“白玉王,二氢山奈酚、杨梅素等在“大10中含量低于“白玉王。黄烷醇与花色素苷类化合物有差异的34种,其中矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素等在“大10中含量高于“白玉王,无色矢车菊素、（-）-表没食子儿茶素、（+）-没食子儿茶素等在“大10中含量低于“白玉王。2.“大10与“白玉王桑椹的转录组测序及差异表达基因分析对桑椹品种“大10和“白玉王成熟期的桑椹进行转录组测序,分析对比2个品种桑椹相关基因表达谱的变化。测序得到32155条基因序列,进一步富集得到3560个差异表达基因,1551个差异表达基因在GO数据库具有功能定义,537个差异表达基因注释到了KEGG数据库。KEGG数据库功能注释关联到216条代谢途径,类黄酮物质代谢相关途径主要有苯丙烷类合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇合成,筛选到黄酮类化合物生物合成的相关差异表达结构基因54个。SWISS-prot和Pfam数据库蛋白结构注释,分析得到可能参与黄酮类化合物合成调控的转录因子MYB有3个MYB176、MYB116和MYB188,转录因子bHLH有2个bHLH102、bHLH227,转录因子WD40有3个WD40-227、WD40-201和WD40-231。2种桑果在黄酮类化合物代谢相关的基因表达存在差异。3.代谢组与转录组联合分析“大10与“白玉王桑椹黄酮类化合物的差异“大10中黄酮类化合物的代谢主要途径为柚配基查尔酮,柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚及其衍生物,二氢槲皮素,槲皮素及其衍生物、天竺葵素及其衍生物、矢车菊素及其衍生物。“白玉王中黄酮类化合主要代谢途径为去甲基黄腐酚,柚配基查尔酮、柚皮素、二氢山奈酚;圣草酚查尔酮、圣草酚、二氢槲皮素、无色矢车菊素,杨梅素。“大10中标志代谢物为矢车菊素-3-葡萄糖苷,“白玉王中标志代谢物为去甲基黄腐酚。转录组与代谢组联合分析进行验证,“大10果实中黄酮类合成的关键基因有CHS242、CHI147、F3’H236、F3’H375、DFR168、ANS206和GT155,“白玉王果实中参与黄酮类化合物合成的关键基因有CHI226、FLS199、FLS265和DFR215。4.桑椹转录因子bHLH的克隆与分析转录因子MYB中推测MYB176参与负向调控“白玉王中黄酮类化合物合成,bHLH102和WD40-227同样参与负向调控,bHLH227在果实成熟转色S3中表达量显著差异,可能参与了“大10中花色素苷途径的调控。bHLH102与苹果的MdbHLH33同源性92%,推测其参与了花色素苷途径调控。利用RACE技术克隆获得bHLH102全长片段大小为2099 bp,对该基因进行生物信息学分析,预测可编码氨基酸的数量为624个,N端存有bHLH-MYC超家族,靠近C端为HLH结构域。bHLH102属于疏水性蛋白,定位在细胞核中。对三级结构预测含有多个α-螺旋和β-折叠结构。通过上述分析,为解析“白玉王中果实颜色消失的分子遗传机理,和新品种选育提供了理论依据。