含牛轮状病毒VP6的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

作     者：邢亚茹 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：左玉柱

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛轮状病毒 乙肝病毒核心抗原 病毒样颗粒 核酸疫苗 VP6蛋白 

摘      要：牛轮状病毒(Brovine Rotavirus,BRV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员,该病毒是导致犊牛病毒性腹泻的主要病原之一,在世界范围内广泛流行,严重影响养牛业的发展。近年研究显示,VP6基因作为BRV常用的分子检测靶点,其编码的VP6蛋白也是常用的血清学检测靶蛋白和亚单位疫苗候选抗原。所以本研究对VP6基因进行克隆表达,为进一步建立血清学检测方法和研究亚单位疫苗奠定基础。并以HBc为载体制备了含有BRV VP6基因的病毒样颗粒,同时构建了重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6,并对其免疫效果进行初步分析,为BRV疫苗的研究提供一定的数据基础。本研究通过PCR扩增分别得到HBcAg(编码1-74aa)、HBcAg(编码83-144aa)和截短的BRV VP6基因,并构建重组质粒pET32a-HBcAg-VP6。经诱导纯化得到约57 kDa大小的重组蛋白HBc-VP6,Western blot检测结果显示,重组蛋白HBc-VP6具有良好的反应原性。对所得重组蛋白进行透析复性以及超滤浓缩后,通过透射电镜可观察到重组蛋白HBc-VP6能够自主装配成病毒样颗粒。本研究参照GenBank中BRV VP6序列,通过PCR扩增得到长度为597 bp的VP6截短基因。构建了重组表达质粒pET32a-VP6,经过诱导剂IPTG诱导得到大小为42kDa左右的蛋白大量表达,Wesstern blot试验表明该重组蛋白VP6对BRV阳性血清有良好的反应原性。本研究根据重组质粒pET32a-HBcAg-VP6的基因序列分别设计两对特异性表达引物,通过PCR扩增得到带有酶切位点Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的融合基因HBcAg(编码1-74aa)-VP6以及带有酶切位点EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ的HBcAg(编码83-144aa)基因。将上述扩增得到的基因分别导入到表达质粒pcDNA3.1,获得重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6。将重组蛋白HBc-VP6、重组蛋白VP6和重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6分别对小鼠进行免疫接种,测定小鼠血清相关抗体、相关细胞因子及攻毒保护效果,同时对重组蛋白是否引起小鼠体内肥大细胞的活化进行了初步研究。结果显示,VP6蛋白、重组蛋白HBc-VP6和重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6都有较好的免疫原性,并且重组蛋白HBc-VP6和重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6的免疫原性优于VP6蛋白。小鼠经重组蛋白刺激后,免疫组小鼠的肥大细胞出现脱颗粒,而PBS组小鼠的肥大细胞几乎没有出现脱颗粒。综上所述,本研究所制备的重组蛋白HBc-VP6、重组蛋白VP6以及重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6均具有良好的免疫原性以及攻毒保护作用,同时可以刺激肥大细胞的活化,但是以HBc为载体制备的重组蛋白HBc-VP6和重组质粒pcDNA3.1-HBcAg-VP6,无论在免疫原性还是攻毒后的保护效果方面都优于重组蛋白VP6。本研究为今后BRV疫苗的研究提供了参考。