肠道微生物在绿僵菌感染黑翅土白蚁过程中的作用机制研究
作者单位：江苏科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：李木旺;王倩
授予年度：2021年
主 题：黑翅土白蚁 绿僵菌 16S r DNA测序 宏基因组 肠道微生物
摘 要：黑翅土白蚁Odontotermes formosanus属于蜚蠊目Blattodea下的白蚁科Termitidae的大白蚁亚科Macrotermitinae,是大白蚁亚科中物种丰富度最高的属,主要分布在非洲和亚洲。它作为高密度群居的社会性昆虫,在整个生活史中会面临各种病原的侵害,因此进化出了一系列独特的免疫机制。已有研究表明肠道共生菌群可以促进宿主的先天免疫,协同宿主来建立免疫体系以增强在自然界的生存能力。白蚁肠道共生菌群在纤维素降解方面的作用已得到确认,但是其在白蚁免疫中的作用及其机制还未见报道。白蚁后肠内有多种共生菌,是一个丰富又复杂的生态内环境。揭示绿僵菌感染宿主后肠道菌群的变化,可以了解到绿僵菌感染过程中肠道菌群是如何应对绿僵菌感染的不利环境的,更为重要的是,通过对昆虫重要免疫活动的研究,会提供更多靶标基因供生物防治利用。本研究利用罗伯茨绿僵菌感染黑翅土白蚁。在解剖镜、光学显微镜和电子显微镜观察到白蚁肠道内变化的基础上,通过16S rDNA测序和宏基因组测序的方法,对其感染前后的肠道菌群结构变化进行分析,鉴定高等白蚁在抵抗绿僵菌感染过程中可能起关键作用的细菌类群,利用宏基因组测序构建感染前后肠道共生菌群的代谢通路,揭示发生显著变化的信号通路,以解析肠道共生菌群在高等白蚁免疫中的具体作用及其分子机制。基于宏基因组数据组装单菌基因组对未培养细菌的代谢潜能做了探讨,揭示了未知微生物对绿僵菌入侵的潜在措施。本研究一方面将对白蚁的免疫机制有新的理解,可以从另一角度理解白蚁共生体的共生机理,丰富共生理论,另一方面有望对白蚁的生物防治提供理论和实践指导。全文主要结果如下:1.本研究分别在解剖镜、光学显微镜和电子显微镜下观察绿僵菌入侵后白蚁肠道内情况。首先绿僵菌的感染会导致白蚁的死亡,而且在感染初期绿僵菌进入了肠道内,并抵达了微生物聚集最多的区域——后肠。绿僵菌的入侵导致了肠道微生物的紊乱,体现为肠道微生物密度的增加。但是到感染末期,也就是群体濒临死亡时,肠道上皮屏障却未遭到破坏,这体现了肠道微生物保护肠道组织不受绿僵菌的感染。2.基于16S rDNA测序对其感染前后的肠道菌群结构变化进行分析,共获得1938个OTU(Operational Taxonomic Units)。其中,能够注释到数据库的OTU数量为1865个。主要研究了肠道菌落整体水平的多样性和相对丰度的变化,以及绿僵菌感染期间显著变化的菌门的变化趋势。本研究发现,在感染初期,白蚁肠道微生物群落的丰度和多样性发生了降低,之后缓慢恢复,最终趋于平衡。体现了菌落水平上,肠道菌群为了应对绿僵菌感染的不利环境所做出的措施。大部分的菌门变化并不明显,说明大部分菌门对于绿僵菌的抵抗能力较强,而存在三种显著变化的菌门脱铁杆菌门Deferribacteres、变形菌门Proteobacteria和螺旋体门Spirochaetes,体现了它们对于绿僵菌感染的敏感性。3.采用Illumina HiSeq平台进行宏基因组测序,质控后进行基因预测,得到792 038个ORF,总长度为472.72 Mbp,其中完整基因数为214 957个。在KEGG数据库中进行通路的注释,发现整体功能在感染中期内有了显著的下调,包括了能量代谢子系统(固碳途径、甲烷代谢、氮代谢、氧化磷酸化和硫代谢)以及细胞运动(细菌趋化性、细菌运动蛋白和鞭毛装配,子系统ABC转运体、磷酸转移酶系统(PTS)和转运体(功能类:膜转运))。但是蛋白质输出和核糖体相关通路在感染初期被激活,暗示了这方面抵抗绿僵菌的手段。同时,本研究注释到了3个免疫通路:NOD样受体信号通路、抗原加工提呈和Th17细胞分化。分析显示,这些免疫通路主要由肠道共生菌中的厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria、螺旋体门Spirochaetes参与了,且三条通路中均发现了Hsp90基因的表达,暗示了Hsp90是白蚁肠道共生菌参与先天免疫的保守基因。此外,本研究使用分箱法(binning)进行了单菌基因组的组装,共分离出了218个微生物基因组草图,其中高质量的基因组草图有36个,通过系统发育分析探讨了白蚁肠道微生物的进化模式。根据物种级基因组仓SGB数据库对每个分箱与其最接近的物种进行注释,得到了两个已知的菌株Trabulsiella odontotermitis,Acinetobacter oleivorans,而绝大多数的微生物基因组属于未知物种,并对高质量微生物基因组进行代谢功能注释,挖掘了未培养菌株的潜在功能。
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