基于Wnt/β-catenin信号通路研究肉苁蓉苷A调控成骨细胞自噬的机制

作     者：陈桐莹 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：万雷

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：骨质疏松症 肉苁蓉苷A 成骨细胞 自噬 Wnt/β-catenin信号通路 

摘      要：目的:明确肉苁蓉苷A对成骨细胞分化、矿化的影响;明确自噬对成骨细胞分化矿化的作用;探索肉苁蓉苷A通过Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞自噬的影响。方法:1.体外分离SD大鼠成骨细胞原代细胞,电镜下观察和碱性磷酸酶染色鉴定,分别将不同浓度的肉苁蓉苷A与成骨细胞共培养1,3,5天,通过CCK-8法筛选出最佳浓度。2.碱性磷酸酶染色,茜素红染色筛选肉苁蓉苷A干预成骨细胞最佳分化矿化浓度。3.采用免疫蛋白印迹法、免疫荧光,透射电子显微镜等方法检测成骨细胞的自噬水平,并用碱性磷酸酶染色,茜素红染色检测,结合自噬促进剂:雷帕霉素Rapa、自噬抑制剂3-MA,进一步明确肉苁蓉苷A通过自噬影响成骨细胞的分化矿化作用。4.用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1干预,碱性磷酸酶染色,茜素红染色,免疫印迹,免疫荧光法检测成骨细胞的自噬水平和分化矿化情况,阐明肉苁蓉苷A通过Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞自噬调控作用。结果:1.CCK-8法显示当肉苁蓉苷A浓度为10μM时,对SD大鼠成骨细胞的无明显增殖作用,但碱性磷酸酶染色,茜素红染色检测表明此浓度下细胞分化和矿化能力最强;2.碱性磷酸酶染色,茜素红染色检测表明SD大鼠成骨细胞发生自噬时促进分化矿化,免疫荧光显示肉苁蓉苷A浓度为10μM、干预时间为5天时,具有促进成骨细胞的自噬功能(P=0.0000.001);3.免疫蛋白印迹法显示肉苁蓉苷A能促进自噬标志蛋白LC3(P=0.0160.05),Beclin-1(P=0.0220.05)和成骨蛋白 Runx2 的表达(P=0.0020.05);4.免疫荧光、电镜检测结果显示肉苁蓉苷A促成骨细胞发生自噬的能力强于自噬促进剂Rapa(P=0.0000.001),免疫蛋白印迹法显示,在引起自噬时,GSK-3β蛋白受抑制(P=0.0470.05),而β-catenin 蛋白上升(P=0.0170.05)。结论:肉苁蓉苷A能促进成骨细胞矿化分化,还能促进自噬的发生,且其促进自噬的能力强于自噬促进剂。Wnt/β-catenin信号通路可能是肉苁蓉苷A调控成骨细胞自噬促进分化与矿化的有效通路。