转基因玉米标准物质-质粒阳性物质构建与检测方法的建立

作     者：任佳丽 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨卫君;王凤格

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：转基因玉米 质粒DNA阳性物质 转基因检测 实时荧光定量 

摘      要：由于转基因作物在中长期可能存在潜在的安全问题,所以我国对于转基因作物有着严格的管理。转基因检测是转基因安全监管中非常重要的组成部分,转基因阳性物质是转基因检测过程中的必需品,转基因阳性物质的研发对于转基因相关检测方法的建立和检测设备的开发起着至关重要的作用。但目前我国还存在着转基因阳性物质缺乏、转基因检测方法还有待优化、转基因玉米种子纯度鉴定方案空缺等问题。本研究针对商业化较多的转基因玉米品种及我国自主研发的转基因玉米品种,分别构建了八个单靶标质粒DNA阳性物质和一个多靶标质粒DNA阳性物质,对构建的质粒DNA分子进行了酶切、菌落PCR及测序等验证;建立多重实时荧光PCR筛查玉米种子转基因成分的体系,优化了转基因检测方法-实时荧光定量PCR还存在一些问题,如不同基因在不用孔内进行扩增,扩增结果的差异会导致转基因定量过程中的误差;建立适用于转基因玉米种子纯度鉴定的多重检测方法可在低成本的条件下对转基因种子进行高效、准确的纯度鉴定,该方法为转基因玉米的纯度检测提供了技术储备,也为其他作物的转基因纯度鉴定提供参考。本文第一部分分别针对转基因玉米TC1507、BT11、MON810、C0030.3.5、SK12-5的特异性序列及转基因元件Ca MV 35S启动子和NOS终止子、玉米内源基因ZSSIIB,构建了8个新型的单靶标质粒分子及1个将上述8个片段构建到同一载体的多靶标质粒标准物质。通过菌落PCR、酶切及测序的方法,确定了9个质粒阳性物质可正常扩增且序列正确,可用于转基因检测中充当阳性参照。本文第二部分为转基因检测中多种检测方法的建立。构建的多重实时荧光定量PCR体系即将Ca MV 35S启动子和NOS终止子、玉米内源基因ZSSIIB在同一个反应体系中检测,该反应体系重复性好、灵敏度高,可应用于转基因定量检测中;构建了多重荧光毛细管体系,将7个SSR位点与转基因元件Ca MV 35S启动子和NOS终止子组合9重PCR体系,应用于转基因玉米种子的纯度鉴定中。本文中共构建9个质粒阳性物质及2种转基因检测体系,易扩繁的质粒阳性物质结合多重的检测体系在满足不同检测需求的同时,也可缩短转基因检测时间、减小转基因检测过程中的误差、降低检测成本,可对其他作物的转基因检测提供参考。