长链非编码RNA GCLC-1沉默对微囊藻毒素-LR致肝细胞恶性转化的影响

作     者：李江恒 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：农清清

授予年度：2018年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：长链非编码RNA lnc-GCLC-1 微囊藻毒素-LR 肝细胞 恶性转化 

摘      要：目的:研究长链非编码RNA GCLC-1(lnc-GCLC-1)在微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MCLR)诱导人肝细胞株L02恶性转化过程中的作用。方法:(1)通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测lnc-GCLC-1在肝细胞和肝组织中的表达量;细胞核/细胞质分离试剂盒分离细胞核组分和细胞质组分,运用q RT-PCR检测lnc-GCLC-1在细胞核和细胞质中的表达情况。(2)构建lnc-GCLC-1沉默及阴性对照的慢病毒表达载体,通过瞬时转染筛选出最佳的短发卡RNA(sh RNA);包装慢病毒,并感染人肝细胞株L02,用嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株;利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光情况以检测转染效果,采用q RT-PCR鉴定转染细胞株。(3)采用人肝细胞株L02,设为正常对照组(CON组)、sh RNA阴性对照组(sh-NC组)、lnc-GCLC-1沉默组(sh-lnc-GCLC-1组)、MCLR染毒组(MCLR组)、sh RNA阴性对照染毒组(sh-NC+MCLR组)和lnc-GCLC-1沉默染毒组(sh-lnc-GCLC-1+MCLR组),常规细胞培养,使细胞始终暴露于10 nmol/L的MCLR,连续染毒至第25代,第10代、15代和第25代细胞分别标记为P10、P15和P25。运用q RT-PCR检测lnc-GCLC-1在MCLR诱导的恶转肝细胞中的表达情况;CCK-8实验检测细胞增殖能力;血清依赖实验评价细胞血清不依赖性生长能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;软琼脂实验评价细胞锚定非依赖性生长能力;划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞体外迁移能力;Transwell侵袭实验评价细胞体外侵袭能力;裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤能力。结果:***染毒15、30及45天细胞中的lnc-GCLC-1表达量均低于相应的未染毒细胞(P0.05);lnc-GCLC-1在肝癌细胞系中的表达量低于正常肝细胞系(P0.05);细胞质中lnc-GCLC-1表达量略高于细胞核;肝癌组织中lnc-GCLC-1表达量低于癌旁正常组织(P=0.000797)。2.重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳可见约8 138 bp的片断,与预期结果一致;酶切后电泳鉴定阳性的质粒经过测序,测序结果与设计一致。瞬时转染sh RNA-2和sh RNA-4后,细胞中lnc-GCLC-1表达量均低于sh-NC组(P0.05),但sh RNA-4转染组下降更显著,故sh RNA-4是最佳的sh RNA,标记为sh-lnc-GCLC-1。慢病毒感染靶细胞后,经0.5μg/ml的嘌呤霉素筛选2周后,几乎所有细胞都有荧光,且lnc-GCLC-1在sh-lnc-GCLC-1稳定转染细胞中的表达水平明显低于sh-NC组(P0.05)。***-GCLC-1在正常对照染毒组、sh-NC转染染毒组和sh-lnc-GCLC-1转染染毒组中的表达量均低于相对应的未染毒组(P0.05)。4.第15代细胞CCK-8实验结果显示,从第2天开始,sh-lnc-GCLC-1+MCLR组增殖速度明显快于sh-lnc-GCLC-1组、MCLR组和sh-NC+MCLR组;到第4天时,各染毒组生长速度明显快于相对应未染毒组(P0.05),且sh-lnc-GCLC-1组生长速度快于CON组和sh-NC组。第25代细胞从第1天开始,各组细胞增殖速度开始出现差异(P0.05);各染毒组生长速度明显快于相对应未染毒组(P0.05);sh-lnc-GCLC-1组生长速度明显快于CON组和sh-NC组(P0.05);sh-lnc-GCLC-1+MCLR组生长速度明显快于MCLR组和sh-NC+MCLR组(P0.05)。与第15代细胞相比,第25代细胞各组间的增殖速度差异提前出现,且增殖速度优于第15代细胞相同组别。5.第25代细胞血清依赖性实验结果显示,在培养24 h后,L02细胞在0.5%、1.5%、4.5%FBS培养条件下各组生长速度均存在显著性差异(P0.05);各染毒组生长速度明显大于相对应未染毒组(P0.05);在1.5%、4.5%FBS培养条件下的sh-lnc-GCLC-1组生长速度明显优于sh-NC组(P0.05);sh-lnc-GCLC-1+MCLR组生长速度明显优于MCLR组和sh-NC+MCLR组(P0.05)。在0.5%、1.5%、4.5%FBS条件下培养48 h、72h和96 h后皆出现类似规律。6.第25代细胞的细胞周期实验结果显示,各染毒组细胞在G0-G1期的比例低于相对应未染毒组(P0.05),MCLR组和sh-NC+MCLR组细胞在G