丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/透明质酸复合支架的制备及性能研究

作     者：南晓茹 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵彬

授予年度：2021年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：丝素蛋白 纳米羟基磷灰石 透明质酸 多孔支架 骨组织修复 

摘      要：目的:为了模拟组织细胞外基质(ECM)的组成成分,采用冷冻干燥法,以丝素蛋白(SF)、纳米羟基磷灰石(nHAp)和透明质酸(HA)为原材料,并加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为交联剂,制备了SF/nHAp/HA多孔复合支架材料。对其理化性能、体外细胞生物相容性以及对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响进行研究,从而为临床中修复骨缺损相关材料提供新思路。方法:1.采用共混、交联、冷冻干燥等方法制备了不同透明质酸(HA)比例的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/透明质酸(SF/nHAp/HA)多孔复合支架材料。分别得到五组样品材料:SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA、SF/nHAp/5.0wt%HA和SF/nHAp/7.5wt%HA。采用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)、万能材料试验机和降解实验等分析技术,对支架的形貌、二级结构、孔径、孔隙率、吸水能力、力学及降解性能进行测量和分析,探讨HA对多孔支架性能的影响。2.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)原代培养并做流式鉴定后,将BMSCs接种于各组支架材料上,评价材料的体外细胞相容性。培养7 d后,利用SEM观察细胞的分布情况及形态。培养1、3和7 d后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况。活/死细胞染色(living/dead staining)后,使用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞活力。3.为了评价材料的体外成骨分化能力,将BMSCs接种于各组材料上成骨诱导4、7和14 d后,用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒进行定量测定。成骨诱导7、14和21 d后,进行茜素红染液染色及钙(Ca)沉积的半定量分析。结果:1.通过SEM观察显示所有多孔支架均具有典型的三维多孔结构,孔隙连续且相互连通。这就说明复合支架中SF、nHAp和HA之间具有良好的相容性且没有明显的团聚和析出现象。SF/nHAp多孔支架中引入HA之后,由于HA的粘度较高,抑制冰核的生长,所以SF/nHAp/HA多孔支架的平均孔径逐渐减小(SF/nHAp组109.6±0.57μm,SF/nHAp/1.5wt%HA组108.8±0.51μm,SF/nHAp/2.5wt%HA组107.1±0.37μm,SF/nHAp/5.0wt%HA组106.3±0.46μm,SF/nHAp/7.5wt%HA组103.0±0.51μm)。相反,多孔支架的孔隙率有所增加(87.5～94.2%)。XRD、FT-IR和XPS结果显示,所有多孔支架都主要由Silk I和少量Silk II结构组成,且复合支架中的HA得到了有效交联。水溶性和力学性能测试结果表明,当HA含量为7.5wt%时,由于Silk I含量不足以包覆高含量HA,使得SF/nHAp/HA多孔支架在水中趋于不稳定。然而当HA的加入量小于5.0wt%,尤其是比例为5.0wt%的SF/nHAp/HA支架具有最高的吸水性和力学性能。降解实验结果表明,HA的加入降低了复合支架的降解速率。2.根据SEM、LSCM及CCK-8等体外细胞实验结果表明,在7d的细胞培养过程中,五组支架材料的细胞数量都呈现出增加趋势,均显示出良好的细胞相容性。然而,BMSCs在SF/nHAp/5.0wt%HA多孔支架上增殖最快,说明适量的HA可以支持细胞的黏附和增殖。3.体外成骨诱导分化实验结果显示,ALP的活性随时间的延长而逐渐增加,且在每个时间点SF/nHAp/5.0wt%HA多孔支架上细胞的ALP活性表达和钙盐沉积量均高于SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%H和SF/nHAp/7.5wt%HA组多孔支架,显示出良好的细胞成骨诱导能力。结论:本研究采用冷冻干燥与化学接枝法合成一种SF/nHAp/HA多孔支架材料,通过控制HA的含量,能有效地调节支架的整体理化性能。通过细胞粘附、活力和增殖实验反映了SF/nHAp/5.0wt%HA相比其他四组材料具有良好的体外细胞相容性;另外,体外成骨诱导分化实验也反映了SF/nHAp/5.0wt%HA具有更好的体外成骨能力。总之,HA提高了复合材料的体外细胞相容性和生物活性,有望为骨组织的修复重建提供了一种新的材料。