丙泊酚参与Keap1/Nrf2通路介导的线粒体自噬保护神经元减少缺血再灌注损伤

作     者：万晓燕 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王士雷

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 100217[医学-麻醉学] 

主      题：丙泊酚 脑缺血再灌注损伤 Keap1/Nrf2通路 线粒体自噬 自噬 

摘      要：目的:丙泊酚是急症抢救,临床麻醉,强化治疗常用的镇静剂。除了镇静作用外,还具有脑保护效应,然而其具体的信号通路尚未完全阐明。本研究旨在探讨在丙泊酚减轻大鼠神经元氧糖剥夺-复氧复糖(OGD/R)损伤中,Keap1/Nrf2信号通路介导线粒体自噬发挥的作用。方法:利用大鼠原代海马神经元氧糖剥夺(OGD6h/R20h)模型模拟脑缺血再灌注损伤,实验共分为四个部分:第一部分探究丙泊酚对于线粒体自噬的诱导作用,分为对照组(C组),赋形剂组(V组),氧糖剥夺再灌注组(OGD/R组),丙泊酚组(P组);对照组无需特殊处理;赋形剂组于复氧复糖即刻加入DMSO,终浓度小于0.1%,无其他处理。氧糖剥夺再灌注组与丙泊酚组神经元均置于无葡萄糖培养基EBSS、温度为37℃的三气培养箱中6 h制备氧糖剥夺模型,然后用含Neurobasal-A,B27,丙酮酸钠及谷氨酰胺的含糖培养基替换无糖培养基,置于常氧条件下继续培养20 h进行复氧复糖。丙泊酚组于复氧复糖即刻加入丙泊酚,终浓度为100nm。采用Western Blot免疫印迹的方法检测自噬蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin、P62及TOMM20的表达,采用m RFP-GFP-LC3(自噬流)检测红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的数量变化进而推测自噬小体与溶酶体的数量变化,采用透射电子显微镜观察线粒体、自噬体数量变化。第二部分探究氧糖剥夺复氧复糖过程中,线粒体自噬的诱导对于脑的保护作用;分为对照组(C组),赋形剂组(V组),氧糖剥夺再灌注组(OGD/R组),丙泊酚组(P组),雷帕霉素组(线粒体自噬激活剂RAPA组),丙泊酚+雷帕霉素组(P+RAPA组);对照组无需特殊处理;赋形剂组于复氧复糖即刻加入DMSO,终浓度小于0.1%,无其他处理。氧糖剥夺再灌注组、丙泊酚组、雷帕霉素组及丙泊酚加雷帕霉素组神经元均置于无葡萄糖培养基EBSS、温度为37℃的三气培养箱中6 h制备氧糖剥夺模型,然后用含Neurobasal-A,B27,丙酮酸钠及谷氨酰胺的含糖培养基替换无糖培养基,置于常氧条件下继续培养20 h进行复氧复糖。丙泊酚组于复氧复糖即刻加入丙泊酚,终浓度为100nm,雷帕霉素组于复氧复糖即刻加入雷帕霉素,终浓度为30μM。采用Western Blot免疫印迹的方法检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达,采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测早期细胞凋亡水平,采用流式细胞术测定细胞凋亡率。第三部分探究丙泊酚对于Keap1/Nrf2通路的作用,分为对照组(C组),赋形剂组(V组),氧糖剥夺再灌注组(OGD/R组),丙泊酚组(P组),鸦胆子苦醇组(Keap1/Nrf2通路抑制剂,Bru组);对照组无需特殊处理;赋形剂组于复氧复糖即刻加入DMSO,终浓度小于0.1%,无其他处理。氧糖剥夺再灌注组、丙泊酚组、鸦胆子苦醇组神经元均置于无葡萄糖培养基EBSS、温度为37℃的三气培养箱中6 h制备氧糖剥夺模型,然后用含Neurobasal-A,B27,丙酮酸钠及谷氨酰胺的含糖培养基替换无糖培养基,置于常氧条件下继续培养20 h进行复氧复糖。丙泊酚组在复氧复糖即刻加入丙泊酚,终浓度为100nm。鸦胆子苦醇组于复氧复糖即刻加入鸦胆子苦醇,终浓度为100nm。采用Western Blot免疫印迹的方法来检测Nrf2蛋白的表达,采用荧光抗体技术来检测Nrf2蛋白氧糖剥夺再灌注过程中是否发生核转位。第四部分探究Keap1/Nrf2通路对于线粒体自噬的诱导作用,分为对照组(C组),赋形剂组(V组),氧糖剥夺再灌注组(OGD/R组),丙泊酚组(P组),TBHQ组(Keap1/Nrf2通路激活剂),丙泊酚+TBHQ组(P+TBHQ组);对照组无需特殊处理;赋形剂组于复氧复糖即刻加入DMSO,终浓度小于0.1%,无其他处理。氧糖剥夺再灌注组、丙泊酚组、TBHQ组及丙泊酚加TBHQ组神经元均置于无葡萄糖培养基EBSS、温度为37℃的三气培养箱中6 h制备氧糖剥夺模型,然后用含Neurobasal-A,B27,丙酮酸钠及谷氨酰胺的含糖培养基替换无糖培养基,置于常氧条件下继续培养20 h进行复氧复糖。丙泊酚组在复氧复糖即刻加入丙泊酚,终浓度为100nm。TBHQ组于复氧复糖即刻加TBHQ,终浓度为5μM。采用Western Blot免疫印迹的方法检测自噬蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin、P62、TOMM20及通路蛋白Nrf2的表达,采用m RFP-GFP-LC3(自噬流)检测红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的数量变化进而确定自噬小体与溶酶体的数量变化,采用透射电子显微镜观察线粒体、自噬体数量变化。结果:1.与OGD/R组相比,P组LC3-II和Beclin蛋白的表达增加,而p62和TOMM20的表达减少(P0.05),差异有统计学意义。m RFP-GFP-LC3结果表明,P组红色荧光(LC3表达)的数量和强度高。透射电镜观察P组出现完整的线粒体及自噬体,且自噬体数量高于OGD/R组。2.与OGD/R组相比,RAPA组Bcl-2蛋白表达上调,BAX的表达降低(P0.05),差异有统计学意义。线粒体膜电位检测示RAPA组红色荧光细胞数量明显高于OGD/R组,流式细胞仪检测RAPA对细胞的影响,结果示雷帕霉素的加入能显著抑制细胞凋亡。3.与OGD/R组相比,P组通路蛋白Nrf2的表达明显上调(P0.05),差异有统计学意义。同时免疫荧光检测结果示,细胞质中的Nrf2蛋白在此过程中发生明显的核转位。4.与OGD/R组相比,TBHQ组LC3-II和Beclin蛋白的表达增加,而p62和TOMM20蛋白表达减少(P0.05),差异有统计学意义。m RFP-GFP-LC3结果表明,TBHQ组红色荧光(LC3表达)的数量和强度高。透射电镜观察TBHQ组出现完整的线粒体及自噬体,且自噬体数量高于OGD/R组。