苏云金芽胞杆菌高产黑色素工程菌株的构建

作     者：詹云达 

作者单位：南开大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡峻

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：苏云金芽胞杆菌 黑色素 芳香族氨基酸转氨酶 对羟苯丙酮酸双加氧酶 尿黑酸双加氧酶 

摘      要：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种能够产生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性菌。Bt来源的微生物杀虫剂现在已经在世界范围上用于防治农作物害虫,但是在野外条件下由于阳光中的紫外线辐射,Bt杀虫剂会迅速失去生物活性。黑色素能够作为光保护剂来提高Bt抗紫外的能力,因此获得一株可以高产黑色素的Bt菌株用来保护杀虫晶体蛋白具有十分重要的意义。我们实验室前期研究发现在大多数Bt菌株中存在尿黑酸(HGA)黑色素合成途径,在该途径中,L-酪氨酸可在芳香族氨基酸转氨酶(PhhC)的作用下转化为4-羟苯基丙酮酸,该产物可在羟苯基丙酮酸双加氧酶(Hpp D)的作用下生成尿黑酸。HGA可在尿黑酸双加氧酶(HmgA)的催化下被分解,而当HmgA发生突变不再具有活性后,HGA会进行氧化聚合,进一步生成脓黑色素。在前期的研究工作中,本实验室敲除了hmgA基因,获得了能产生黑色素的Bt菌株BMB171(35)hmgA,但该突变菌株的黑色素产量并不高。为获得高产黑色素的Bt菌株,本研究以能够产黑色素的BMB171(35)hmgA为出发菌株,进行了系列研究。首先探究L-酪氨酸的量对黑色素产量的影响。当培养基中L-酪氨酸低于1.2 g/L时,随着L-酪氨酸浓度的逐渐增加,反应黑色素产量的OD的值也在不断升高。与不添加L-酪氨酸的对照相比,添加L-酪氨酸后发酵上清OD提升幅度较小,最高能增加到1.39倍,说明L-酪氨酸底物的量并不是限制黑色素产量的主要因素。当培养基中L-酪氨酸到达1.4 g/L时,黑色素产量反而有一定的下降。因此可以通过在培养基中添加1.0 g/L～1.2g/L浓度的L-酪氨酸来提高黑色素的产量。芳香族氨基酸转氨酶(PhhC)是HGA黑色素合成途径的代谢酶之一,可能对黑色素的产量有着一定的影响。实验室前期的研究只是确定在Bt中存在HGA黑色素合成途径,并未明确Bt中对应的PhhC。根据NCBI上BMB171基因组的注释,发现有两个基因可能编码PhhC-1(AQY41390)和Phh C-2(AQY40477)。成功构建这两个基因的过表达菌株以及phh C-2基因的敲除株,确定这两个基因能够编码在HGA途径中起作用的芳香族氨基酸转氨酶。过表达PhhC-2的菌株(35)hmgA-P-phh C-2在添加L-酪氨酸(1.0 g/L)的LB培养基中发酵,与在LB培养基中培养对照菌株的(35)hmg A-pCB发酵液相比,OD的值能增加到1.85倍,说明提高芳香族氨基酸转氨酶的量也能提高黑色素的产量。在本研究中利用一系列强启动子表达羟苯基丙酮酸双加氧酶(HppD),发现利用强启动子Prsi构建的重组菌株BMB171 Prsi-hppD黑色素产量最高。在含有1.0 g/L L-酪氨酸发酵培养基中该重组菌株的的黑色素产量与在LB培养基中的对照菌株(35)hmg A-pCB相比大概增加到3.77倍。此基础上,在本研究中构建了一株同时过表达phhC-2和hppD的菌株BMB171 Pdc-2,发现黑色素的产量大幅度提高,在含有L-酪氨酸(1.0 g/L)的发酵培养基中BMB171 Pdc-2的OD的值为10.50左右,与在LB培养基中培养的BMB171(35)hmg A-pCB相比增加到5.70倍,即将HGA途径中的phh C-2和hppD两个关键酶同时过量表达,且也没有L-酪氨酸底物限制时,黑色素产量最高可增加到5.70倍,此外,我们发现增加培养基中的溶氧量虽然不能提高黑色素的产量,但可加速黑色素的生成,缩短发酵时间。本研究获得的高产黑色素的Bt菌株对Bt杀虫剂的工业化应用具有重要实际价值。