Beagle犬骨膜细胞膜片的体外构建研究

作     者：王启松 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：骆凯

授予年度：2020年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：骨膜细胞 细胞膜片 牙周组织工程 同种异体移植 牙周再生 

摘      要：实验一Bealge犬骨膜细胞体外培养及多向分化能力检测目的体外培养犬骨膜细胞(periosteal cells,PCs),研究其多向分化的能力。方法采用组织块法培养Bealge犬骨膜细胞,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色检测细胞的成骨分化能力、油红O染色检测细胞的成脂分化能力、Alcian blue染色检测细胞的成软骨分化能力;通过集落形成试验检测细胞的克隆形成能力。结果采用组织块法可成功分离培养PCs,经矿化诱导液培养7d,细胞ALP染色明显;成骨诱导21d,茜素红染色可见明显着色的钙结节;成脂诱导21d,油红O染色可见胞内有明显红染的脂滴。成软骨诱导21d,细胞Alcian blue染色呈阳性表达;细胞贴壁培养14d,经结晶紫染色肉眼可观察到着色的克隆集落,单细胞形成的克隆呈集落状生长。结论采用组织块法可成功培养出PCs,所培养的细胞具有克隆形成能力并具有成骨、成软骨及成脂分化潜能。实验二Bealge犬骨膜细胞膜片的构建研究目的构建Beagle犬PCs膜片,并对PCs细胞膜片的结构进行观察。方法采用富含维生素C的培养液构建Beagle犬PCs细胞膜片,在PCs膜片培养成熟后,小心刮取完整的细胞膜片,通过HE、甲苯胺蓝染色对细胞膜片的组织形态进行观察;通过细胞死活荧光染色检测细胞膜片内的细胞活性;通过扫描电镜和透射电镜观察细胞膜片的超微结构。结果采用富含维生素C的培养液可成功构建出完整的PCs膜片,细胞膜片成熟后,肉眼可观察到白色的半透明膜状结构,HE和甲苯胺蓝染色可见膜片由多层细胞和细胞外基质组成。细胞死活荧光染色后可见细胞膜片内由大量活细胞组成。扫描电镜观察可见细胞膜片内细胞间存在大量的细胞外基质,透射电镜可见细胞膜片内细胞生长状态良好,可见粗面内质网和线粒体等细胞器,细胞间连接紧密。结论采用富含维生素C的培养液可成功构建出PCs膜片,能有效的实现种子细胞的转移;所获取的细胞膜片由大量活性细胞和ECM组成,细胞自身所分泌的ECM可以充当种子细胞附着的天然支架,有望应用于牙周组织的修复再生。实验三Beagle犬骨膜细胞膜片实现牙周组织再生的实验研究目的应用同种异体PCs膜片移植修复Beagle犬慢行牙周炎牙周组织缺损,探讨其应用于牙周组织再生的可行性。方法构建5只成年Beagle犬慢性牙周炎动物模型,将30颗受试牙随机分成三组:PCs膜片植入组(n=10)、β-TCP植入组(n=10)和空白对照组(n=10)。于建模前、建模后4周记录牙周探诊深度、临床附着水平和探诊出血阳性率;PCs膜片移植8周后收集下颌骨标本,采用Micro-CT和组织切片染色分析牙周组织再生的效果。结果本实验成功构建Beagle犬慢性牙周牙周炎动物模型,临床检查显示牙胶放置4周后,牙周探诊深度、临床附着水平和探诊出血阳性率均有上升,牙周组织炎症明显;Micro-CT和组织切片染色分析显示PCs膜片组和β-TCP组均获得较好的牙周组织再生,其中PCs膜片组的再生情况优于β-TCP组和空白组。结论同种异体PCs膜片移植可实现Beagle犬慢行牙周炎牙周组织再生,可为临床牙周治疗提供帮助。