靶向Aβ1-42蛋白的多肽设计及其作用研究

作     者：曹帅 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李宁

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 10[医学] 

主      题：Aβ1-42 多肽抑制剂 分子对接 虚拟筛选 

摘      要：阿尔茨海默病是导致痴呆症的最主要原因,其患者占到痴呆症患者的60%至80%。Aβ聚集成纤维最后形成老年斑被认为是AD发生的关键步骤。因此有效抑制Aβ聚集是一种非常有前景的策略。目前研究中,针对Aβ蛋白聚集的抑制剂在前期研究中具有一定的抑制效果,但在后续研究中结果并不理想,所以迫切需要开发全新的多肽抑制剂。本研究利用分子对接虚拟筛选技术,设计了能够抑制Aβ蛋白聚集的多肽。体外合成后验证其对Aβ蛋白聚集的抑制效果,为开发高效低毒的靶向Aβ蛋白的多肽抑制剂提供新的解决方案,并为下一步开发能够预防AD的功能性食品和治疗AD的药物奠定理论基础。本研究主要分为以下三个部分:1、靶向Aβ蛋白的多肽设计Aβ蛋白的的高分辨率结构的解析为本研究的成功实施奠定了基础。本研究利用分子对接虚拟筛选技术,构建了2-3个氨基酸残基的虚拟肽库。将肽库中的多肽与Aβ蛋白上的活性位点进行对接。根据一致性评分函数Cscore值对分子对接的结果进行综合评价,设计了30条能够特异性识别Aβ蛋白的多肽序列。使用SYBYL/MOLCAD模块分析多肽和Aβ蛋白两者之间的相互作用力。结果表明,多肽与Aβ蛋白之间的相互作用力主要是氢键和疏水相互作用。2、多肽理化性质、生物活性及细胞毒性测定对上述获得的30条多肽通过Peptide Ranker、Innovagen、DPL、Toxin Pred等多种在线工具对多肽的生物活性、水溶性和毒性进行预测。预测结果表明本研究获得的多肽均不具有毒性且具有良好的水溶性,其中多肽P2702是最可能具有生物活性的多肽。通过CCK-8法检测细胞活力来评价多肽对PC12细胞的毒性,结果表明本研究涉及多肽除P8、P9、P11、P24在较低浓度已产生明显毒性外,其余20余条多肽在本研究浓度下的细胞活力与对照组相比,均不具有显著性差异,与预测结果基本一致。为后续在细胞水平上进行抑制效果的研究提供了帮助。SPR检测多肽与Aβ之间的亲和力常数KD值,结果表明研究涉及多肽均与Aβ蛋白存在较好的亲和特性,最高达到320n M。3、多肽对Aβ蛋白聚集及细胞毒性的作用研究通过Th T荧光实验评价多肽对Aβ蛋白聚集的抑制效果。结果表明本研究中的30条多肽均可显著抑制Aβ蛋白的聚集。综合评价后选择P7、P21、P22、P2696、P2700、P2702通过PC12细胞活力实验检验多肽对Aβ聚集产生的细胞毒性的抑制效果。结果表明,6条多肽均可在一定程度上抑制Aβ聚集诱导的细胞毒性,其中P7、P2696在与Aβ浓度比为1:1时,细胞活力达到最高,最高接近100%。P21、P22、P2700、P2702在与Aβ浓度比为4:1时,细胞活力达到最高,最高可达到100%。通过对两者结合模式的研究探讨了本研究涉及多肽对Aβ的发挥抑制作用的可能机制。