基于网络药理学探讨益肾活血方调节PI3K/AKT/HIF-1α信号通路抗肾纤维化的机制研究

作     者：方桂玉 

作者单位：广西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钟建

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：益肾活血方 肾纤维化 网络药理学 炎症 血管新生 P13K/Akt/HIF-1α信号通路 

摘      要：目的1、利用网络药理学技术以及Cytoscape可视化软件,研究益肾活血方治疗肾纤维化的有效成分及可能的作用靶点,探讨益肾活血方治疗RIF的作用机制。2、探讨益气活血法对肾纤维化大鼠PI3K、AKT、HIF-1α、VEGF蛋白表达及炎症因子IL-6、TNF-α浓度的影响。方法1、利用中药系统药理学(TCMSP)建立益肾活血方的七味中药黄芪、当归、丹参、大黄、红花、三七、牛膝的化合物库;Gene Cards数据库、OMIM数据库预测RIF的靶点;构建益肾活血方化合物靶点-RIF疾病靶点互作网络,并通过DAVID网站对靶点网络进行GO分析和KEGG富集分析,最后采用cytoscape软件对分析结果做可视化网络图。2、动物实验:将36只(体重260±20g)清洁级雄性SD大鼠随机分为六组:假手术组组、模型组、氯沙坦组、益肾活血方低剂量组、益肾活血方中剂量组、益肾活血方高剂量组,每组6只。适应性饲养3天后,假手术组予游离单侧输尿管处理,余五组均用单侧输尿管结扎大鼠模型,益肾活血方不同剂量组和氯沙坦组予以对应的药物灌胃,假手术组和模型组按生理盐水灌胃,疗程14天。各组于药物干预的第14天取材,行HE、Masson染色,并用Western blot法检测各组肾组织VEGF、PI3K、AKT、HIF-1α的蛋白表达,用ELISA检测血清炎性因子IL-6、TNF-α的浓度。结果1网络药理学本研究通过TCMSP化合物分析平台筛选,得到105个化合物;Gene Card、OMIM等靶点预测平台找到了188个益肾活血方化合物-RIF疾病映射靶点进行蛋白互作分析,可见蛋白互作频次较高的有蛋白激酶相关受体(AKT1、MAPK1、MAPK8、JUN等),炎症相关受体(IL-6、IL-1B、TNF等),生长因子相关受体(VEGFA、EGFR ESR1等),根据GO分析显示这些核心靶点主要涉及类固醇激素受体活性、转录因子结合催化功能、蛋白激酶的活性、细胞因子活性等分子功能,涉及炎症趋化因子的调控、白细胞介素-6产生的调控、表皮生长因子激活的调控、肾上腺素能受体信号通路激活MAPK活性等生物过程,可能是通过抑制成纤维细胞因子生长分化、抑制炎症趋化反应、抑制炎症反应、抑制细胞凋亡、抗氧化应激等多靶点发挥对RIF的治疗作用。P13K-Akt、TNF、MAPK、HIF-1、VEGF、TLR、NF-κB信号转导通路等细胞信号通路提示为益肾活血方参与肾纤维的重要通路。以核心靶点IL-6、VEGF、MAPK、AKT1、EGFR、PTGS2为研究载体,对益肾活血方化学成分进行分子对接研究,结果显示益肾活血方化学成分与关键靶点具有较好的结合活性。2.1 HE染色与假手术组相比,模型组大鼠肾脏组织的肾实质重度萎缩变薄,肾小球数量减少、萎缩,部分肾小管呈囊性扩张,间质纤维组织增生。与模型组相比,氯沙坦组与益肾活血方各剂量组的肾实质呈轻到中度萎缩,肾小球萎缩、数量减少,部分肾小管呈囊性扩张。纤维化程度减轻。2.2 Masson染色与假手术组相比,模型组大鼠梗阻侧肾脏组织的胶原纤维蓝染增多,间质胶原纤维形成明显,肾脏组织的小管基底膜及管周围纤维组织显著增生。与模型组相比,氯沙坦组与益肾活血方各剂量组大鼠梗阻侧肾脏组织中胶原纤维蓝染减少,小管基底膜及管周围纤维组织呈中度增生。2.3 PI3K、AKT、HIF-1α、VEGF蛋白表达第14天,模型组的PI3K、AKT、HIF-1α、VEGF的蛋白表达均高于假手术组,组间比较均有统计学意义(P0.05)。2.4炎性因子IL-6、TNF-α浓度第14日,模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α的浓度均高于假手术组(P0.05)。结论1.网络药理学结论表明益肾活血方可能是通过参与炎症反应、血管内皮因子生长分化、氧化应激、表皮生长因子增殖、免疫应答等生物过程,调控P13K/Akt、HIF-1α、VEGF、MAPK、NF-ΚB、TLR等信号通路发挥延缓RIF发生发展作用。2.实验研究证明益肾活血方能够抑制肾纤维化大鼠的PI3K、AKT、HIF-1α、VEGF蛋白表达,降低血清炎性因子IL-6、TNF-α浓度,其作用机制可能在于益肾活血方抑制P13K/A