脐带间充质干细胞治疗急性肝衰竭的疗效及作用机制探讨

作     者：廖海玲 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨晋辉

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：脐带间充质干细胞 急性肝衰竭 My D88 NF-κB 炎症 凋亡 

摘      要：[目的]研讨脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells UMSCs）治疗实验性急性肝衰竭（Acute liver failure ALF）的疗效以及其可能涉及的相关机制。[方法]1.将66只BALB/C小鼠在SPF环境下喂养一周,使其适应周围环境。随机抽取10只小鼠组成空白组,采取腹腔注射的方式给予900mg/kg的生理盐水。剩余56只小鼠,并通过腹膜内注射的方式给予D-GalN和LPS,D-GalN的给药剂量为900mg/kg,一共给予两次,两次给药之间需要间隔十二小时。第二次给予D-GalN后,可以10ug/kg的剂量给予LPS。待给药完成后,在56只小鼠中随机抽取28只小鼠组成模型组,剩余28只小鼠组成实验用药组。用药组通过尾静脉注射UMSCs 5 ×10^6个/只,模型组和空白组的小鼠均不注射UMSCs。2.在建立肝衰竭模型和移植UMSCs后的12h、1d、2d通过眼球采血分别采取小鼠外周血,检测小鼠外周血中AST、ALT及TBil的变化,以评估肝功能状况;用ELISA试剂盒测定各组小鼠12h、1d、2d以及用药组小鼠5d、7d、14d、21d及28d外周血中TNF-α、IL-6及IL-1β炎症因子的水平;分别取模型组和用药组小鼠肝脏组织制作HE染色切片、免疫组化切片、提取DNA和RNA,观察小鼠肝脏组织的病理学变化以及检测各组小鼠肝脏My D88、NF-κB、Bax、以及Bcl-2在分子水平上的表达情况。[结果]1.成功建立小鼠急性肝衰竭模型。通过腹腔注射给予小鼠D-GalN（900 mg/kg）及LPS（10μg/kg）,给药后每12h记录一次小鼠的死亡数量,当药物注射48h时,模型组小鼠全部死亡,生存率为0%。给药后,与空白组小鼠外周血中ALT、AST和TBil的含量相比,模型组和用药组小鼠的外周血中肝功能指标的含量开始逐渐增高（p0.05）。HE染色的结果表明,给药后,模型组和用药组中小鼠的肝脏结构遭到破坏,表现出肝细胞胞质水肿,局部区域性膨胀,肝细胞发生变性坏死,以及出现许多的炎性细胞,病理切片符合ALF的肝脏损伤现象。以上结果证明小鼠ALF模型被成功建立。2.模型建立后,选取28只小鼠通过尾静脉移植UMSCs,移植后观察小鼠生存率发现用药组小鼠的死亡数量逐渐减少,UMSCs移植后48h时,尚有25只小鼠存活,相比于模型组,UMSCs移植能有效提高小鼠存活率达90%（p0.05）。生化检测结果显示,UMSCs移植后用药组中小鼠外周血中ALT、AST和TBil的水平随着移植时间延长而逐渐降低（p0.05）。HE染色的结果表明,移植UMSCs7d时,用药组小鼠的肝细胞的坏死开始逐渐改善,炎症细胞逐渐减少。此外,我们观察到门户区域的胆管明显增生。移植后UMSCs 21d时,小鼠的肝脏结构与正常结构无明显差异。基于以上结果,我们认为,UMSCs对于治疗小鼠ALF具有十分显著的疗效。3.空白组小鼠肝脏中My D88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β和Bax的表达维持在较低水平,Bcl-2的表达则相反。而在LPS/D-GalN诱导后My D88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β和Bax的表达开始逐渐增加,Bcl-2的表达则被明显抑制（p0.05）。UMSCs移植后,用药组小鼠肝脏中My D88和NF-κB表达减少,抑制IκB的磷酸化,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达被抑制,促凋亡因子Bax的水平逐渐下降,而抗凋亡Bcl-2的水平逐渐增高（p0.05）,以上结果表明,通过下调My D88/NF-κB通路,从而达到抗炎症、抗细胞凋亡的目的可能在UMSCs治疗ALF中发挥了重要作用。[结论]1.小鼠急性肝衰竭模型可以通过腹腔注射LPS（10ug/kg）/D-GalN（900mg/kg）成功建立***可以通过改善小鼠肝功能以及修复小鼠损伤的肝脏,减轻LPS/D-GalN诱导的肝损伤。***可以通过抑制My D88/NF-κB信号通路,一方面使促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达减少,从而缓解急性肝衰竭的炎症反应,另一方面通过抑制促凋亡基因Bax的表达,增强凋亡抑制基因Bcl-2的表达抗细胞凋亡,来缓解肝脏损伤。