SKA2促进肺癌细胞增殖和迁移的分子机制初探

作     者：孟佩新 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卜友泉;陈全梅

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：SKA2 PDSS2 CoQ10 肺癌细胞 细胞迁移 

摘      要：SKA2(spindle and kinetochore associated complex subunit 2),也称FAM33A(family with sequence similarity 33,member A),是纺锤体与动粒相关复合物(spindle and kinetochore associated complex,Ska)的一个亚基,在细胞周期调控和肿瘤等疾病发生发展过程中具有重要作用。我们前期发现,SKA2在肺癌组织中的表达显著上调,参与调节肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但其具体的分子行为机制仍不清楚。本研究旨在进一步探索SKA2促进肺癌细胞增殖、迁移的分子机制。(1)SKA2在肺癌中表达显著上调我们通过GEPIA数据库分析SKA2在TCGA数据集肺癌组织中的表达情况,结果表明,与对照正常肺组织相比,SKA2在肺癌组织表达显著上调,且SKA2的表达水平与肺癌患者生存率呈显著负相关。(2)SKA2基因沉默对肺癌细胞系A549基因表达谱的分析我们对Rice等发表的在肺癌细胞A549中沉默SKA2基因的芯片数据进行了进一步生物信息学技术分析。对SKA2基因沉默导致的差异表达基因进行了基因功能聚类(Gene ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,结果表明,差异表达基因显著富集于物质转运、基因转录调控和氧化还原等生物学过程,同时提示SKA2基因沉默可能导致PDSS2(Prenyl diphosphate synthase subunit2)等多个参与生物合成代谢途径的关键酶基因表达上调。采用RNA干扰技术抑制肺癌A549细胞中SKA2的表达,RT-PCR结果初步验证确认,SKA2基因沉默可导致ABCA1基因下调,PDSS2基因表达显著上调。PDSS2是参与CoQ10生物合成途径的第一个酶,也是其关键酶,值得进一步研究。(3)SKA2抑制PDSS2的表达,降低CoQ10的含量为了进一步确认SKA2是否可以调控PDSS2的表达和CoQ10的合成,我们构建了SKA2过表达质粒pcDNA3.0-SKA2并且使用RNA干扰技术沉默SKA2。RT-PCR和免疫印迹分析结果表明,过表达SKA2后,PDSS2表达显著降低,CoQ10B水平降低,而干扰SKA2后,PDSS2表达明显增加,CoQ10B水平升高。该数据提示SKA2可在m RNA和蛋白水平上抑制PDSS2基因的表达,并进而抑制CoQ10的合成。为了确认SKA2是否可以调节PDSS2基因的转录,我们将PDSS2启动子的不同截短体和SKA2过表达质粒pcDNA3.0-SKA2共转染肺癌细胞A549,检测PDSS2基因启动子活性。结果表明,SKA2对PDSS2核心启动子在内的多个启动子截短体的活性均有抑制作用。该结果表明,SKA2可在转录水平上抑制PDSS2基因的表达。(4)CoQ10对肺癌细胞增殖和迁移能力的影响我们首先分析了CoQ10对肺癌细胞A549增殖和迁移能力的影响。在肺癌细胞A549中分别添加50μM和100μM的CoQ10,观察细胞增殖情况,结果显示,CoQ10对A549细胞的增殖无显著影响。同时,划痕愈合实验结果表明,CoQ10对肺癌细胞A549的迁移能力也没有显著影响。(5)CoQ10对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响接下来,我们进一步分析CoQ10是否调节其他癌细胞如结直肠癌细胞SW480和RKO的增殖和迁移能力。结果表明,CoQ10对结直肠癌细胞SW480的增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移能力均无明显影响,对RKO的增殖也无明显影响,但可抑制RKO的迁移。(6)CoQ10抑制结直肠癌细胞RKO迁移能力的分子机制初探我们采用RNA-seq技术分析了划痕愈合实验条件下CoQ10处理所导致的RKO基因表达谱变化。GO和KEGG分析结果表明,差异表达基因显著富集于细胞粘附分子信号通路、细胞外基质受体信号通路和胆固醇信号通路等。定量RT-PCR验证结果表明,CoQ10处理确实可导致胆固醇合成通路中的PCSK9、HMGCR、HMGCS1和DHCR7基因以及胞外基质通路中的MMP10基因表达显著上调,提示CoQ10可能通过调节这些基因的表达来抑制结直肠癌细胞RKO的迁移能力。综上,本研究在前期研究基础上对SKA2促进肺癌细胞增殖和迁移的分子机制进行了初步探索,发现SKA2可以抑制PDSS2的表达,并可能进而抑制CoQ10合成,为进一步探索SKA2在肺癌发生发展中的作用奠定了坚实的基础。同时,我们还发现CoQ10可能通过影响胆固醇代谢来抑制结直肠癌细胞的迁移能力,对进一步探索CoQ10在肺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的分子机制和治疗价值有重要的理论和现实意义。