猪瘟病毒抑制猪小肠上皮细胞Ⅲ型干扰素产生的机制研究

作     者：李晓烨 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：方维焕

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪瘟病毒 Ⅲ型干扰素 Npro IRF1 

摘      要：猪瘟是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）引起的高度传染性疾病,给养猪业造成重大经济损失。该病毒可突破机体的粘膜屏障以建立感染。Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN-Ⅰ和IFN-Ⅲ）是天然免疫系统的重要组成部分,由宿主PRRs识别病毒因子后产生。已知CSFV通过Npro蛋白激活蛋白酶体,降解干扰素调节因子3（IRF3）,抑制IFN-Ⅰ的产生。IFN-Ⅲ在黏膜上皮细胞的抗病毒天然免疫中起关键作用。但是,关于CSFV是否以及如何调节IFN-Ⅲ迄今未见报道。本课题应用基因缺失、过表达或沉默技术,结合报告基因、免疫印迹、激光共聚焦等技术,研究了 CSFV及其Npro蛋白对IFN-Ⅲ表达的影响以及对IRF1表达和入核的影响。利用qPCR方法检测了 CSFV感染的IPEC-J2细胞中IFN-Ⅲ（IFN-λs:IFN-λ1、IFN-λ3和IFN-λ4）的转录水平,结果表明:缺失Npro的CSFV株（ANpro）诱导的Ⅲ型干扰素（IFN-λs）转录水平明显高于其亲本毒株（wtCSFV）。qPCR结合IFN-λ3启动子活性检测结果显示,wtCSFV显著抑制poly（I:C）处理的IPEC-J2细胞中IFN-λs转录和IFN-λ3启动子活性,而△Npro没有显示出这种抑制作用。构建重组真核表达质粒pCMV-Npro并转染IPEC-J2细胞,我们发现Npro过表达可显著降低IFN-λs转录和IFN-λ3启动子活性。这些结果表明,CSFV的Npro蛋白抑制IFN-Ⅲ表达。已知人和小鼠的IRF1是IFN-Ⅲ表达的主要调控蛋白。我们通过IPECT-J2细胞的IRF1过表达或irf1基因沉默,结合qPCR和报告基因活性检测,表明猪IRF1也是IFN-Ⅲ表达的正调控因子。qPCR和免疫印迹检测结果表明,wtCSFV和ΔNpro感染均可诱导IPEC-J2细胞中IRF1的表达并呈现时间依赖性,其中ΔNpro表现出更显著的诱导作用。wtCSFV感染显著抑制poly（I:C）处理IPEC-J2细胞中的IRF1启动子活性及其表达水平,而△Npro株感染对IRF1没有抑制作用;pCMV-Npro转染IPEC-J2细胞,结合poly（I:C）刺激,我们发现CSFV通过Npro抑制IRF1表达。激光共聚焦结果显示,wtCSFV感染或Npro蛋白过表达可以抑制poly（I:C）处理IPEC-J2细胞中IRF1的入核。本研究提供了明确的证据,证明CSFV通过Npro蛋白抑制IRF1表达及其核移位,从而抑制IFN-Ⅲ的产生,可能是CSFV突破宿主肠上皮细胞的先天免疫防御机制之一。这一发现加深了猪瘟病毒逃避宿主固有抗病毒免疫机制的认识。