PI3K/AKT/mTOR通路在微囊藻毒素-LR致小鼠精原细胞恶性转化中的作用及机制
作者单位：郑州大学
学位级别：硕士
导师姓名：张慧珍;高利华
授予年度：2021年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
主 题：微囊藻毒素-LR 细胞恶性转化 PI3K/AKT/mTOR通路 精原细胞瘤
摘 要：目的微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR）是一种具有促肿瘤活性的蓝藻毒素,环境中蓝藻毒素暴露可能是精原细胞瘤的发生的重要诱因。本研究旨在探讨MC-LR对精原细胞恶性转化的影响,并揭示PI3K/AKT/m TOR通路在MC-LR诱导小鼠精原细胞恶性转化中的调控作用及其机制,为精原细胞瘤的发生提供病因线索。方法***-LR染毒浓度和染毒方式的确定通过CCK8试剂盒联合酶标仪检测不同浓度MC-LR对小鼠精原细胞（GC-1）增殖能力的影响,以此确定MC-LR的染毒剂量。将MC-LR染毒GC-1细胞,每3天传代一次,使细胞始终暴露于特定浓度的MC-LR,如此培养35代,取第15、25和35代细胞及其同代对照组细胞用于后续实验。***-LR多代染毒对GC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响Western Blot和免疫荧光检测多代染毒后GC-1细胞中MC-LR的蓄积情况;显微镜观察细胞形态的改变;细胞增殖实验、划痕实验、Transwell实验检测MC-LR多代染毒对细胞增殖、迁移和侵袭能力改变。***-LR多代染毒GC-1细胞的裸鼠成瘤实验MC-LR染毒35代GC-1细胞及其同代对照组细胞注射于裸鼠皮下28天后测量肿瘤的重量和体积;苏木精-伊红染色对肿瘤组织进行病理分析;免疫组化检测肿瘤组织中肿瘤标志物Ki67的水平。***-LR多代染毒对GC-1细胞中PI3K/AKT/m TOR通路及下游蛋白的影响Western Blot检测MC-LR多代染毒GC-1细胞中PI3K/AKT/m TOR通路蛋白（PIK3CA、PIK3CB、AKT、m TOR）及下游增殖、迁移和侵袭相关蛋白（c-MYC、CDK4、CCND1、MMP14）的激活情况。***3K/AKT/m TOR通路在MC-LR诱导的GC-1细胞恶性转化中的作用使用PI3K抑制剂Wortm预处理MC-LR染毒第35代GC-1细胞及其同代对照组24 h后,Western Blot法对GC-1细胞中PI3K/AKT/m TOR通路及下游相关蛋白进行检测;细胞增殖实验、划痕实验、Transwell实验检测MC-LR多代染毒对细胞增殖、迁移和侵袭能力改变;碘化丙啶染色法联合流式细胞术检测MC-LR染毒35代以及Wortm预处理后的GC-1细胞周期分布的改变。结果***-LR可以进入并在GC-1细胞中蓄积MC-LR的浓度在20 n M时可以增强GC-1细胞的增殖能力（P0.05）,确定MC-LR染毒剂量为20 n M。Western Blot和免疫荧光结果发现,随着染毒时间的增加,MC-LR的条带和荧光强度也随之增强（P0.05）。***-LR多代染毒诱导GC-1细胞发生恶性转化MC-LR染毒GC-1细胞35代后,细胞呈堆积性生长,出现细胞核增大、胞核与胞浆分界不清等形态学改变,同时细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强（P0.05）。MC-LR染毒35代后在裸鼠皮下后形成肿瘤体积和重量高于同代对照组（P0.05）,染毒组形成的肿瘤细胞具有异型性,分布弥漫性更高且排列紊乱具有精原细胞瘤样特征,染毒组肿瘤中Ki67的表达水平高于对照组（P0.05）。***-LR多代染毒激活GC-1细胞中PI3K/AKT/m TOR通路及下游蛋白MC-LR染毒35代后精原细胞中PI3K/AKT/m TOR通路蛋白（PIK3CA、PIK3CB、AKT、m TOR）及下游增殖、迁移和侵袭相关蛋白（c-MYC、CDK4、CCND1、MMP14）被显著激活（P0.05）;***3K/AKT/m TOR通路参与MC-LR诱导的GC-1细胞恶性转化过程PI3K抑制剂Wortm预处理后,被MC-LR激活的PI3K/AKT/m TOR通路及其下游蛋白均被显著抑制（P0.05）。Wortm预处理降低MC-LR多代染毒代后增强的GC-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P0.05）。***3K/AKT/m TOR通路介导细胞周期失调参与MC-LR诱导的GC-1细胞恶性增殖MC-LR连续染毒GC-1细胞35代后,GC-1细胞周期的G0/G1期分布减少,S期分布增加;将恶性转化的精原细胞使用Wortm进行预处理后,显著缓解了MC-LR诱导的细胞周期G1期向S期转换（P0.05）。结论***-LR多代暴露激活PI3K/AKT/m TOR通路诱导小鼠精原细胞恶性转化。***3K/AKT/m TOR通路介导的细胞周期失调参与MC-LR诱导的小鼠精原细胞恶性增殖。
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