拟南芥CRY2与TCP8形成蓝光特异相分离颗粒调控免疫相关基因ICS1的表达

作     者：张峻川 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：左泽乘

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：拟南芥 转录因子 蓝光受体 转录调控 植物免疫 相分离 

摘      要：光是植物赖以生存的环境因素之一。在植物体内,存在许多光受体,如红光受体PHY,紫外光受体UVR8,蓝光受体CRY等。蓝光受体隐花色素CRY2是植物体内重要的光受体之一,它能调控光周期开花,下胚轴伸长,生物钟节律等。CRY2在蓝光的刺激下能够形成光小体,但是该现象并未有具体的解释。目前,对于生物大分子发生液-液相分离的现象的研究越来越深入,生物大分子形成的相分离颗粒具有如同液滴的性质,即能够融合,并且能够和外界进行物质交换。细胞内的生物大分子通过这种形式形成一个无膜的细胞结构,从而使得生物大分子的局部浓度增加,提高生化反应效率,也使得细胞能从时间和空间上控制反应的进行。本研究拟通过对CRY2与其互作蛋白形成的光小体的时间,圆度,分配率以及各个蛋白内部的无序区判断CRY2与TCP8能够形成液-液相分离颗粒,并且初步探究形成相分离颗粒后该颗粒的功能,具体的研究结果如下:1.利用荧光倒置显微镜激光激发CRY2与其互作蛋白形成光小体,并利用Image J进行分析,结果表明CRY2-TCP8形成的光小体速度最快。圆度以及分配率的分析表明CRY2/TCP8的平均圆度以及分配率远远高于其他实验组。分析CRY2以及各互作蛋白的IDR区域,CRY2于CCE结构域存在IDR区域,而TCP8在其蛋白NC两段存在两段较长IDR,高于其他互作蛋白。故选择CRY2-TCP8实验组进行相分离定性实验。2.利用1,6-己二醇处理原生质体后进行共聚焦显微镜成像可知,1,6-己二醇处理抑制CRY2与TCP8形成光小体,CRY2突变体CRY2与TCP8同样无法形成光小体。此外,CRY2与TCP8可以形成圆形的颗粒,两个颗粒能融合成一个新的更大的颗粒,并且形状在融合后恢复圆形。荧光漂白恢复实验可以得知CRY2-TCP8颗粒的荧光信号可恢复至漂白前65%左右,而CRY2-CRY2颗粒只能恢复至20%,并可初步断定CRY2与TCP8形成的光小体即为相分离颗粒。3.致病菌注射入野生型,TCP8-OX/cry2以及cry2突变体中可知,3天之后TCP8-OX/cry2与cry2都表现出相同的弱于野生型的抗性,即TCP8对植物免疫的调控作用依赖于CRY2。己二醇处理后,蓝光促进ICS1表达量升高受到抑制。4.单独的TCP8在蓝光和黑暗下均无法使得ICS1表达量升高,而加入CRY2与LWD2后,同样无法使得ICS1表达量升高,只有加入CRY2,LWD2,TCP8之后,在蓝光处理下,能够使得ICS1表达量上升。CRY2-TCP8和LWD共相,说明CRY2可能能募集LWD蛋白进入CRY2-TCP8的相分离颗粒。