RNF43在胰腺癌中的表达及发生发展中的作用

作     者：陈敏学 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王琛

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胰腺癌 RNF43 发生发展 

摘      要：研究目的胰腺癌（Pancreatic adenocarcinoma,PAAD）是起源于胰腺外分泌腺的恶性肿瘤,预后较差。近年来,虽然胰腺癌的诊断与治疗得到了巨大的改善,但目前为止尚无诊断和治疗胰腺癌的特异性分子标记物和特效药物。环指蛋白43（Ring finger protein 43,RNF43）是一个能够调控肿瘤细胞发生和增殖的E3泛素蛋白连接酶。RNF43在大部分癌症中频繁发生突变且高表达,表达特性与患者预后息息相关,具有重要的临床意义。本研究将通过生物信息学方法预测RNF43在胰腺癌中的突变和表达情况及可能的作用通路,并使用实验方法检测RNF43在胰腺癌中的表达及其与患者临床数据之间的关系,分析RNF43对胰腺癌发生发展的重要作用,旨在为胰腺癌患者的早期诊断、预后评估及靶向治疗提供帮助。方法1生信学分析本研究通过HPA数据库、GENT数据库、GEPIA数据库、c Bio Portal数据库、Oncomine数据库、UCSC Xena数据库及GEPIA数据库分析了RNF43基因在人体正常组织、肿瘤组织中的表达水平及突变频率、突变类型和突变位点,其次使用CCLE数据库分析了41种胰腺癌细胞系中RNF43的相对表达量,最后我们通过TCGA数据库、GEO数据库分析了RNF43在胰腺癌发生发展中作用的功能及通路。2实验验证通过RT-PCR、WB以及IHC验证胰腺癌细胞、正常胰腺细胞及43例胰腺癌组织及与之相对应的癌旁正常组织中RNF43的表达情况,与此同时采集并分析IHC对应患者的临床数据和生存期。随后采用慢病毒敲除RNF43基因建立基因敲除细胞株,采用细胞功能实验、裸鼠成瘤实验体内体外验证了RNF43对胰腺癌细胞功能的影响。结果1 RNF43在多种人体正常组织中低表达,其中在正常胰腺组织中,RNF43蛋白表达评分高于RNF43 m RNA表达评分,然而RNF43在多种肿瘤组织中表达增高,RNF43在胰腺癌中的表达中位数是正常胰腺组织的2.30倍。2 RNF43多种肿瘤组织中频繁发生突变,在胰腺癌中存在多个突变位点,最常见的为zf＿RING＿2位点的移码突变,突变后引起基因大量扩增,且基因拷贝数变化与RNF43的表达相关。3 Oncomine、UCSC Xena、GEPIA、HPA数据库分析结果显示RNF43在胰腺癌中的转录及翻译水平均高于正常组织（P0.05）。CCLE数据库结果显示RNF43在多种胰腺癌细胞系中表达,在As PC-1及Bx PC-3细胞中表达量上调,PANC-1以及MIA Pa Ca-2细胞中表达量下调。4 RT-PCR、WB以及IHC结果提示与正常胰腺细胞及组织相比,胰腺癌细胞及组织中RNF43表达较高（P0.05）,RNF43蛋白主要分布于胰腺癌细胞质及细胞核表面。5 RNF43的表达水平与胰腺癌患者的肿瘤N分期（P=0.0440）、是否存在远处转移（P=0.0248）及其血清中CA19-9含量（P=0.0464）密切相关,而与患者年龄、性别、T分期及肿瘤分化程度无关（P0.05）。较之RNF43低表达患者,RNF43高表达的胰腺癌患者生存期明显延长（P0.05）。6 CCK-8、克隆形成及流式细胞术等功能实验表明RNF43基因通过抑制胰腺癌细胞的生长活力、增殖能力及增加GO/G1阻滞,抑制了胰腺癌细胞的生长和肿瘤的形成,表明RNF43基因在胰腺癌的发生发展中发挥了抑癌功能。7裸鼠皮下成瘤实验表明RNF43基因的缺失可以在体内促进胰腺癌肿瘤的生长。结论RNF43基因在胰腺癌中频繁突变,且突变后表达增高,表达量与患者临床病理特征相关,且RNF43高表达患者预后更好,RNF43在胰腺癌的发生发展中发挥抑癌功能,RNF43可能是评估胰腺癌患者预后的新型分子标记物和治疗胰腺癌的分子靶点。