超大孔微球协同超滤技术的蛋白质复性研究

作     者：徐雅妍 

作者单位：中国石油大学(华东) 

学位级别：硕士

导师姓名：曲剑波;姜进举

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：超滤复性 蛋白质 超大孔微球 协同效应 

摘      要：超滤复性是蛋白质体外重折叠的方法之一,但是由于蛋白质在复性过程中容易发生聚集产生沉淀,造成严重的膜污染,再加之超滤复性工艺优化困难,所以,目前有关超滤在蛋白质复性方面的报道相对较少。针对超滤复性存在的上述问题,本论文开展了以下三个方面的研究工作,并取得了较为理想的实验结果。首先,本论文将用于蛋白质超滤分离工艺优化的“参数扫描超滤技术引入蛋白质超滤复性过程,实现了溶菌酶超滤复性工艺参数的快速优化。经单因素优化后,利用截留分子量为10 k Da的聚醚砜超滤膜对溶菌酶进行超滤复性的最佳工艺为:初始溶菌酶浓度0.1 mg/m L,尿素浓度2 M,复性缓冲溶液p H 8.5,不需要添加Na Cl,复性温度25oC,复性时间8 h。在此条件下,溶菌酶的复性收率可达63.8%。其次,本论文将能够促进蛋白质折叠的超大孔微球引入超滤复性过程,建立了超大孔微球协同超滤技术的蛋白质复性方法。考察了微球结构特性(微球尺寸、孔径和P(NIPAM-co-BMA)聚合物刷接枝量)对溶菌酶复性效果的影响,确定了促进溶菌酶复性效果最佳的微球(粒径76μm,孔径320 nm,接枝量35.6 mg/m)种类。此外,此微球的最佳添加量为7 mg/m L,重复使用5次对溶菌酶复性效果的影响不明显。与单纯的超滤复性相比,加入超大孔微球后,溶菌酶的最适初始浓度由0.1 mg/m L提高到0.4mg/m L,且膜污染的程度大大降低。最后,通过对五种蛋白质(超氧化物歧化酶、脂肪酶、漆酶、牛血清白蛋白和葡萄糖氧化酶)变性前后的粒径分析和超滤膜截留实验,本论文选用截留分子量为100 k Da的聚醚砜超滤膜对牛血清白蛋白进行超滤复性分离一体化操作。结果发现,复性后的牛血清白蛋白在滤出液中(占初始量的83%)具有正确的空间二级结构,截留液中剩余的牛血清白蛋白(占初始量的11%)不具有正确的空间二级结构。这说明基本实现了牛血清白蛋白的超滤复性分离一体化操作。