Komagataeibacter xylinus B2-1基因组碳代谢分析及利用无患子果壳提取液合成细菌纤维素的研究

作     者：卯海龙 

作者单位：福建师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋咏梅;韩永和

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：细菌纤维素 Komagateibacter xylinus B2-1 全基因组测序 无患子果壳 碳源 吲哚-3-乙酸 

摘      要：细菌纤维素（Bacterial Cellulose,BC）是由微生物合成的一种新型的生物高分子材料,由于其独特的性质,细菌纤维素在食品加工、医疗、纺织、电子产品等行业有广泛的应用前景。但目前BC的低产量、高成本限制了它的工业化生产和应用。因此,如何低成本高效率地提高BC产量成为目前亟待解决的问题。本研究分离得到一株BC的生产菌,对其全基因组进行测序,通过分析其基因组特征以及BC合成、调控相关的关键功能基因,对该菌株的BC合成能力进行预测。探究碳源种类对BC合成的影响,并以无患子果壳提取液为原材料成功合成BC。通过IAA作为BC的增产因子从代谢角度初步探究其对BC合成的机理。主要研究内容如下:从福建“民间茶宝的菌膜分离到一株BC的生产菌株,全基因组测序鉴定为Komagataeibacter xylinus菌属,命名为B2-1。分析其基因组序列,发现B2-1基因组在KEGG数据库中注释到有大量与BC合成相关的开放阅读框（ORFs）,其中与BC合成、调控直接相关的基因有12个ORFs,参与能量代谢与碳源相关的ORFs有216个,共有十多种调控碳源代谢的ORFs,结合BC的合成途径,可推测该菌株具有BC合成底物多样性。对BC合成系统中的纤维素合成酶（BCs）的分析发现,在KEGG中注释到的有4个BCs的ORFs,分别有BCs A、BCs B、BCs C、BCs Z等纤维素合成酶基因和bgl X辅基。然而,未注释到常见的BCs D操纵子而存在BCs Z操纵子结构。对BC调控系统（c-di-GMP系统）分析得知基因fol B、cpd P、phn P、glp Q和bdc A对c-di-GMP共同进行调控。基于全基因组分析,选取7种碳源为合成BC的底物,结果显示,以果糖和葡萄糖作为碳源产生的BC产量较高,分别为2.31 g/L和1.92 g/L。此外,不同碳源来源的BC在结构和性能上也有很大的差异。所有BC的吸水性能相差不大,而复水性则表现出较大的差异,山梨醇和甘露醇所产BC的复水率最高（分别为91.9%和92.1%）,葡萄糖次之,乳糖所产BC复水率最低为70.2%。对BC的微观结构进行表征,发现它们虽形态有所不同,但均为纳米级别的纤维丝,且有大量的亲水性官能团,以葡萄糖为碳源时所产BC的结晶度最高。为降低BC的生产成本,首次尝试使用无患子果壳为BC合成的原材料。首先,用酸水解对无患子果壳的多糖进行提取,分别考察4个单因素之后,再进行正交优化实验,结果发现酸水解法最高提取多糖产率为50.3%。以无患子提取液为原材料,对菌株B2-1合成BC的条件进行优化,发现温度为30℃、p H为6、固液比为1:8时可获得最高的BC产量（1.3-1.6 g/L）,且连续一次培养优于分批培养发酵。有趣的是在以无患子果壳提取液为底物时,菌株B2-1对碳源的利用率比在葡萄糖中更高。对无患子果壳提取液与Hestrin–Schramm（HS）培养基所产BC进行显微结构表征,发现其结构基本一致。以上结果表明,无患子果壳提取物有望取代BC合成的商业化碳源,使BC的生产成本大幅度降低。向培养基中添加有机酸、茶多酚、IAA等外源物检测其对BC合成的增产作用,结果发现添加6 mg/L的IAA,BC产量可以提高35.0%,达到2.47g/L。添加IAA有助于菌体生物量的增加和碳源的消耗。通过测定碳源代谢途径和BC合成途径中的6种关键酶的活性,发现IAA总体上对这些关键酶的活性有增强作用,这从代谢角度可以解释IAA促进BC合成原因。