棕榈酸通过阻滞STAT3信号通路抑制胃癌生长和转移

作     者：于晓娟 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐有志

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌 棕榈酸 增殖 信号转导和转录激活子-3(STAT3) 

摘      要：【研究背景】胃癌是全球第五大常见的癌症,也是全球第三大常见癌症导致死亡的主因,胃癌在我国也属于高发的疾病之一。临床胃癌患者5年生存率不到30%。在分子水平上对于胃癌的致癌机制又知之甚少。尽管到目前为止已经研究了许多预测和治疗胃癌的相关生物标志物,但临床上大多数胃癌被诊断时和发现时已经处于晚期阶段,其结果直接导致了胃癌的整体临床预后很差。然而,原发肿瘤、区域淋巴结和远处转移（TNM）分期相同的临床胃癌患者往往表现出不同的临床症状。本文从临床胃癌组织的代谢产物和脂质方面入手开展研究工作,通过应用脂质组学及一系列细胞分子生物学方法,探讨胃癌发展的关键影响因素及其潜在的治疗靶点。最近已有研究报道显示,脂肪酸（FA）代谢在多种癌症的发生和发展中起着关键作用。许多研究提示,脂肪酸合成或脂肪酸氧化有关的基因与肿瘤的转移、耐药和复发等恶性表型有关。脂肪酸合成和氧化之间的失衡可能导致脂肪酸水平不足、脂质堆积。我们通过脂质组学的结果发现脂肪酸中的饱和脂肪酸--棕榈酸在胃癌中的表达较低,进而研究棕榈酸在临床胃癌组织中表达较低的潜在作用和潜在的相关机制。信号转导和转录激活子-3（STAT3）起初一直被认为是一种潜在的胞浆转录因子,可被干扰素和相关细胞因子激活,从而驱动调节炎症和免疫的急性期基因的表达。随着研究的不断深入,越来越多的研究表明STAT3是一种多效性的转录因子,通常在各种癌症中被激活后参与分化、增殖、凋亡、转移、血管新生和代谢过程而发挥癌基因的作用。与其他STATs家族蛋白不同的地方是,STAT3包含了6个已被证实的结构域:分别为NH2-末端结构域、卷曲线圈结构域、DNA结合域、接头结构域、Src同源2（SH2）结构域和转录激活结构域6个部分。其转录活性依赖于转录激活区Tyr705的磷酸化。磷酸化的STAT3可以通过SH2磷酸化酪氨酸发挥相互作用进而与其他的STAT蛋白家族成员形成同源二聚体或者异源二聚体,并且移位进入细胞核内激活基因转录活性。已有报道显示,PIAS3是STAT3的内源性抑制因子,同时参与了多种癌症的发生和发展过程。然而,棕榈酸通过调控p-STAT3-PIAS3信号通路中相关分子的表达进而影响胃癌细胞的生长和转移的作用和潜在机制仍不清楚。本文旨在探讨棕榈酸在胃癌细胞中发挥的作用以及可能的潜在机制。我们前期应用超高液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术进行的脂质组学分析结果表明,棕榈酸在临床胃癌组织中的表达下调,并且150μM水平的棕榈酸能显著抑制人源胃癌细胞的增殖、侵袭和诱导胃癌细胞凋亡的发生。STAT3调控包括细胞增殖转移代谢等其他相关细胞信号的转导,我们的研究结果显示棕榈酸作用于人源胃癌细胞后可以有效抑制了p-STAT3的蛋白表达,并上调了PIAS3基因的表达。棕榈酸不仅抑制了p-STAT3的蛋白表达,还抑制了p-STAT3的核转位及入核表达。通过研究棕榈酸抑制胃癌细胞增殖活性等的潜在机制有望为研究胃癌的发生发展提供新的思路。【研究方法】（1）通过MTT法、平板克隆法、Ed U染色法检测棕榈酸对人源胃癌细胞增殖的影响。通过Transwell侵袭实验检测棕榈酸对人源胃癌细胞侵袭能力的影响。（2）应用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染技术检测棕榈酸处理后人源胃癌细胞的凋亡情况。（3）通过生存曲线分析研究STAT3和PIAS3基因与胃癌病人总生存期和预后的关系。（4）通过免疫印迹技术（Western Blot,WB）,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测p-STAT3、PIAS3和p-JAK2在临床组织或人源细胞中的表达情况,以及应用棕榈酸处理人源细胞后检测p-STAT3、PIAS3、p-JAK2、N-cadherin和Vimentin等的表达情况。（5）应用H＆E染色技术鉴别临床胃癌组织与癌旁组织,免疫组织化学技术（IHC）检测p-STAT3在临床胃癌和癌旁组织中的表达情况。（6）应用免疫荧光（IF）技术检测棕榈酸处理人源细胞后p-STAT3的核转位情况。【研究结果】（1）细胞增殖活性MTT实验24h、48h和72h结果显示,棕榈酸对于四种人源胃癌细胞抑制增殖的作用相较于人源胃上皮正常细胞和肝正常细胞,抑制作用更为显著,而且其对胃癌细胞增殖的抑制效果呈现浓度依赖式增强。平板克隆（BSA、50μM、100μM、200μM）实验结果显示,200μM棕榈酸显著抑制人源胃癌细胞的平板集落形成能力。同样应用Ed U细胞增殖实验检测结果显示50μM棕榈酸处理后,MGC-803细胞Ed U阳性率由空白对照组的80.0%降至30.6%。与MTT和平板克隆实验结果具有一致性。细胞Transwell侵袭实验结果显示,随着棕榈酸浓度的增加,抑制细胞侵袭的作用逐渐增强。（2）Annexin V-FITC双染实验结果显示,棕