i-PRF对人骨髓间充质干细胞成骨分化影响及其机制

作     者：王佳 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：殷丽华

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：i-PRF 骨髓间充质干细胞 成骨分化 ERK1/2通路 PLCγ1通路 

摘      要：目的:富血小板纤维蛋白在口腔软硬组织再生中应用广泛,但其机制尚未明了,本实验旨在探究注射型富血小板纤维蛋白（injectable-PRF,i-PRF）对人骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells）生物学行为影响,以及该细胞在成骨分化过程中作用及其机制。材料与方法:通过全骨髓贴壁法,根据间充质干细胞特性获得细胞后,通过流式细胞仪检测细胞表面分子以及干细胞多向分化能力对细胞进行鉴定。获得人肘前臂静脉血后通过700rpm室温离心3分钟后获得i-PRF。通过扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）和人生长因子阵列膜检测其显微结构和分子组成。并将获得的i-PRF置于完全培养基后获得含有10%、20%和40%的i-PRF。将对照组与各个实验组刺激细胞后通过CCK-8（Cell counting kit-8）、细胞迁移实验、活/死细胞染色确定后续实验浓度。使用含有10%、20%的i-PRF在含有或不含有诱导液的条件下与BMSCs体外培养并通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性检测、茜素红染色以及通过RT-q PCR检测成骨相关基因表达。本实验并通过RT-q PCR和Western Bolt探究i-PRF在促进BMSCs成骨分化过程中分子机制。结果:BMSCs表面CD90及CD44阳性率达到97.65%和96.37%,CD34和CD45的阳性率为3.57%和2.35%。并通过成骨分化诱导21天、成脂诱导28天后成骨及成脂诱导阳性。扫描电镜下观察i-PRF为高密度的三维网状结构,含有大量的白细胞和血小板嵌入其复杂的纤维蛋白结构中,并通过人生长因子阵列膜半定量检测i-PRF中所含生长因子类别,其中不仅大量含有EGF,IGF,PDGF等已知因子,还有M-CSF-R,以及β-NGF等尚未报道过的因子。CCK-8结果显示:第3天开始,各组出现差别,直至第7天,含有10%及20%的i-PRF对比空白组细胞增殖率高。但含有40%的i-PRF在第7天细胞增殖则进入了静止期,在所有实验组中以20%的i-PRF在3、5、7天促进细胞增殖作用效果最为显著。并通过活/死细胞染色发现,i-PRF生物相容性良好,所有实验组均无死细胞并且其中通过染色证明10%和20%i-PRF组细胞增殖效果最为明显。以及通过细胞迁移实验进一步证实10%和20%浓度的i-PRF组在促进细胞迁移作用效果最佳。在成骨诱导过程中通过ALP活性和茜素红染色发现,20%浓度的i-PRF可诱导BMSCs成骨分化并显著促进分化。RT-q PCR结果显示,成骨相关基因Runx2,COL1,OCN,OPN在7天培养后,10%和20%i-PRF显著促进Runx2和COL1的表达,但在OCN、OPN的表达上,实验组20%i-PRF可促进其表达但并无显著意义。最终通过RT-q PCR和Western Bolt探究其成骨分化机制中,经过i-PRF处理过的细胞发现,p-ERK1/2以及p-PLCγ1经过i-PRF刺激后,比对照组其表达量分别增加47.2%和66%,并且成骨相关蛋白Runx2的表达也有所增加,并高达72.7%。与加入抑制剂U0126相比,可见到Runx2、p-ERK1/2以及p-PLCγ1的表达与相应对照组相比均被抑制。RT-q PCR检测也发现相同结果,ERK1/2以及基因PLCγ1经过i-PRF刺激后,基因表达量增加,与加入抑制剂U0126相比,可见到ERK1/2、Runx2以及PLCγ1的表达被抑制。结论:i-PRF可诱导BMSCs成骨分化,可能通过活化ERK1/2通路正向调控BMSCs的成骨分化并促进PLCγ1的表达。