PEBP4调控芳香化酶的表达和雌激素合成的实验研究

作     者：刘婷 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗志军

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：PEBP4 颗粒细胞 芳香化酶 PKA 雌激素 

摘      要：目的:PEBP4(磷脂酰乙醇胺结合蛋白4)是参与调控肿瘤发展、肌细胞分化等多种生物功能的蛋白因子,随着研究的逐渐深入,PEBP4新的功能被不断地挖掘和发现。本课题组前期发现PEBP4雌鼠均呈现体重增加、胰岛素耐受等现象。有趣的是,我们发现PEBP4雌鼠的雌激素水平显著下降,这提示PEBP4全新的一个功能。因此本课题采用体内、体外实验研究PEBP4在雌激素调控中的作用及分子机制。方法:1.姬姆萨染料对六周龄小鼠的阴道分泌物进行染色,挑选性周期相同的小鼠,分离PEBP4和PEBP4小鼠卵巢,计算小鼠卵巢体重比指数。HE染色比较小鼠卵巢形态学差异及免疫组化比较PEBP4和PEBP4小鼠卵巢芳香化酶和PKAc的表达。2.ELISA检测PEBP4和PEBP4小鼠血清雌二醇的水平,Western blot和qPCR检测小鼠卵巢组织和小鼠颗粒细胞雌激素相关指标的表达。3.采用慢病毒包装系统构建PEBP4敲除稳定cov434细胞株,采用Western blot和qPCR验证PEBP4敲除对雌激素相关指标表达的影响。4.采用IGF1和Insulin刺激cov434细胞激活PI3K信号通路、FSH和8-br-cAMP刺激cov434细胞激活PKA信号通路,Western blot比较芳香化酶的表达。5.ELISA检测cov434细胞在睾酮、PI3K抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126以及PKA激活剂8-br-cAMP刺激作用下的雌二醇生成。6.qPCR检测PEBP4敲除对芳香化酶启动子mRNA表达的影响,Western blot验证PEBP4是否影响cAMP反应元件CREB的磷酸化。结果:1.处于发情后期的小鼠中,对比PEBP4野生型,PEBP4敲除小鼠的卵巢体重比指数下降,卵巢卵泡数量明显减少(p0.05),IHC结果表示PEBP4小鼠卵巢的芳香化酶和PKAc表达明显降低(p0.05)。2.PEBP4小鼠血清的雌激素水平对比PEBP4小鼠明显降低(p0.01)。PEBP4敲除下调小鼠卵巢和颗粒细胞的芳香化酶、FSHR等指标的表达(p0.05)。3.与cov434野生型细胞相比较,PEBP4敲除下调cov434细胞株芳香化酶、FSHR、IGF1R等指标的表达(p0.05)。4.IGF1和Insulin对cov434野生型细胞芳香化酶的表达无显著性影响,但FSH和8-br-cAMP能较好地增强cov434野生型细胞芳香化酶的表达(p0.01)。5.PEBP4敲除细胞株培养上清雌激素水平降低(p0.05),且LY294002、U0126对细胞雌二醇分泌无显著性影响;虽然8-br-cAMP增强雌二醇的分泌(p0.05),但不能完全取代PEBP4的功能,提示PEBP4影响多种调节因子。6.PEBP4敲除下调芳香化酶启动子Ⅱ、1.3的mRNA转录,也抑制了CREBP的磷酸化。结论:因此,我们研究表明:1,PEBP4敲除降低卵巢颗粒细胞中雌激素的生成和阻滞卵巢的发育;2,PEBP4敲除影响小鼠卵巢中多种信号因子的表达;3,PEBP4通过影响芳香化酶启动子Ⅱ,1.3之间的CREB结合位点调控芳香化酶的转录,这可能揭示着PEBP4的一个新功能。