毛囊神经嵴干细胞对神经束膜细胞的作用及机制研究

作     者：于皓杰 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘芳

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：神经束膜细胞 毛囊神经嵴干细胞 共培养 增殖 迁移 外泌体 

摘      要：周围神经损伤的研究较为广泛,近年来对于神经束膜细胞的研究显示,其除了形成血-神经屏障,还对周围神经损伤的修复有重要作用,如在受损区域形成神经束膜桥、吞噬细胞碎片、与施万细胞相互作用等。在周围神经受损后,神经束膜细胞率先向受损处迁移并吞噬细胞碎片,早于施万细胞的启动,形成细胞桥以桥接神经缺损;而施万细胞的迁移和轴突的再生则在此之后发生。因此,神经束膜细胞可能在多细胞动员修复周围神经损伤的过程中发挥关键的作用,值得深入研究。神经束膜细胞的增殖缓慢,迁移能力比较弱,提高神经束膜细胞的增殖和迁移能力、加速神经束膜桥的形成,有望为周围神经损伤修复提供新思路。但目前对于神经束膜细胞的培养还没有十分理想的方案,故神经束膜细胞参与神经损伤修复的机制研究也受到较大限制。毛囊神经嵴干细胞(hair follicle neural crest stem cells,hfNCSCs)是一种起源于神经嵴,位于毛囊隆突部的成体干细胞。hfNCSCs像神经干细胞一样特异性表达Nestin,可分化为神经元、施万细胞以及其他多种类型的细胞。目前已形成共识,hfNCSCs可促进周围神经损伤的修复,而其是否可以作用于神经束膜细胞目前仍是未知。本课题创新性地采用“限时消化-差速贴壁-化学药物纯化方案,培养获得高纯度的神经束膜细胞,同时培养大鼠触须垫hfNCSCs,建立hfNCSCs和神经束膜细胞的共培养体系,探索hfNCSCs对神经束膜细胞增殖和迁移的作用。此外,对hfNCSCs外泌体(hfNCSCs exosomes,hfNCSCs-Exos)进行提取、鉴定,以hfNCSCs-Exos作用于神经束膜细胞,测序分析hfNCSCs-Exos micro RNA靶基因的生物学功能及通路,探讨hfNCSCs促进神经束膜细胞增殖及迁移的可能机制,以期为提高神经束膜细胞的增殖和迁移能力提供重要的理论基础及实验依据。第一部分神经束膜细胞及hfNCSCs的分离、培养、纯化及鉴定目的:体外获取活性强、纯度高的神经束膜细胞及hfNCSCs,为周围神经损伤修复的研究提供稳定的细胞来源。方法:神经束膜细胞的分离、培养、纯化及鉴定:取100g左右的Sprague-Dawley(SD)大鼠,取其坐骨神经,仔细剥除神经外膜及神经纤维获取神经束膜。将神经束膜放入Collagen I包被的培养板,于孵箱内37℃、5%CO2贴块1h,之后添加神经束膜细胞的完全培养基。10d后去除组织块,采用“限时消化-差速贴壁-化学药物纯化方案对细胞进行纯化:将细胞用0.25%含EDTA胰酶处理10s以去除施万细胞,将剩余细胞制成细胞悬液放入培养瓶内,于37℃、5%CO2培养30min以初步去除成纤维细胞,转移细胞悬液至新培养瓶。3d后重复上述步骤。重新接种细胞24h后,添加100μmol/L阿糖胞苷处理细胞24h,去除剩余的成纤维细胞,2d后取细胞进行免疫细胞化学鉴定,Claudin-1标记神经束膜细胞,S100标记施万细胞,vimentin标记成纤维细胞。hfNCSCs的分离、培养及鉴定:取50g左右的雄性SD大鼠,解剖大鼠触须垫毛囊,获得毛囊隆突部,放入Collagen I包被的培养板中37℃、5%CO2贴块30min,之后添加hfNCSCs完全培养基。取2代细胞进行免疫细胞化学鉴定,nestin标记hfNCSCs,S100标记施万细胞,Tuj标记神经元。结果:1.神经束膜细胞免疫细胞化学染色结果显示,未经纯化的细胞中,Claudin-1阳性率为42.33%,vimentin阳性率为50.33%,S100阳性率为15%;经“限时消化-差速贴壁纯化后,Claudin-1阳性率为65%,vimentin阳性率为37.66%,S100为阴性;经“限时消化-差速贴壁+100μmol/L阿糖胞苷纯化的细胞,Claudin-1阳性率为97.66%,vimentin阳性率为5.66%,S100为阴性。***免疫细胞化学染色结果显示,nestin阳性率为96%,而几乎没有细胞表达S100和beta III Tubulin。结论:采用“限时消化-差速贴壁-化学药物纯化方案可获得纯度较高和生长状态良好的神经束膜细胞;所培养获得的hfNCSCs大部分处于未分化状态,保持良好的干性。第二部分hfNCSCs对神经束膜细胞增殖、迁移的影响目的:探讨hfNCSCs对神经束膜细胞增殖和迁移的影响。方法:制备hfNCSCs条件培养基,设条件培养基1﹕1组和1﹕2组,分别作用于神经束膜细胞24h、48h及72h,无条件培养基组为对照组。用CCK8法和免疫细胞化学染色检测细胞OD值及增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。建立Transwell共培养体系,上室种植神经束膜细胞,下室设hfNCSCs组和无细胞组,经6h、12h和18