DNMT3b SUMO化介导的MMP-2表达上调在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用研究

作     者：王翰 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：熊源长

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：MMP-2 DNMT3b SUMO化 紫杉醇 CIPN 神经病理性疼痛 

摘      要：研究目的紫杉醇是肿瘤治疗中常用的化疗药物,但在应用过程中常常引起化疗药物所致的周围神经病变（CIPN）,在临床上表现为痛觉过敏和痛觉超敏,并且其具体病理生理机制仍不清楚。已有研究表明基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在脊神经结扎（SNL）诱导的神经病理性疼痛中起关键作用,并可能参与慢性疼痛的形成,但其在CIPN中的作用尚不明确。本研究旨在探讨MMP-2在CIPN的作用,并进一步探索其表达上调的具体机制,为CIPN的治疗提供新的思路。研究方法***-2在紫杉醇诱导的大鼠CIPN模型中的表达情况大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组。Von Frey纤毛进行疼痛行为学测试。提取对照组和模型组不同时间点大鼠脊髓,q PCR检测MMP-2 m RNA表达,WB检测MMP-2蛋白表达。另有模型组大鼠14天灌注后提取脊髓,冰冻切片后行IF检测MMP-2在脊髓背角表达的具体细胞位置。2.鞘内应用MMP-2 si RNA对大鼠疼痛行为学的影响大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组,紫杉醇+对照si RNA组,紫杉醇+MMP-2si RNA组。分别用q PCR和WB检测MMP-2 m RNA和蛋白表达情况,验证si RNA作用。Von Frey纤毛进行疼痛行为学测试。3.探索MMP-2基因启动子区甲基化对其表达的影响首先通过Methprimer网站在线预测MMP-2基因启动子区甲基化位点,Me DIP检测对照组和模型组MMP-2基因启动子区甲基化的改变。然后大鼠鞘内应用DNA甲基化转移酶（DNMTs）抑制剂5-Aza C,q PCR和WB检测其对MMP-2 m RNA和蛋白表达情况的影响。4.探索紫杉醇诱导的CIPN模型中DNMTs的改变首先对对照组和模型组不同时间点大鼠行q PCR,检验DNMTs m RNA表达的改变。然后结合文献及在线预测软件推测其可能发生的蛋白质翻译后修饰,并通过IP检验DNMTs修饰程度的改变,确定MMP-2可能的上游DNMT分子。5.鞘内应用SUMO化抑制剂GA检测其对MMP-2的影响大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组,紫杉醇+溶剂组,紫杉醇+GA组。首先通过IF检验上游DNMT分子与MMP-2在脊髓背角共定位情况。IP检测GA对上游DNMT分子SUMO化程度的影响。q PCR和WB检测GA对MMP-2 m RNA和蛋白表达情况的影响,进一步通过Ch IP和Me DIP检测DNMT分子与MMP-2基因结合程度及MMP-2基因启动子区甲基化的变化。研究结果1.紫杉醇可引起机械性痛觉过敏,q PCR及WB结果显示MMP-2 m RNA和蛋白在开始注射紫杉醇后第7天和第14天表达升高。IF结果显示MMP-2表达于脊髓背角神经元。2.鞘内应用MMP-2 si RNA可有效抑制其表达升高,并部分缓解机械性痛觉过敏。***预测结果显示MMP-2启动子区发生甲基化的区域为（-587—-796）和（-1096—-1226）。针对特定区域设计引物,Me DIP结果示紫杉醇组MMP-2启动子（-1096—-1226）区域甲基化降低。q PCR,western blot结果示鞘内注射5-AZA后MMP-2表达升高。***显示紫杉醇处理后不同时间点DNMTs m RNA表达情况无明显改变,进一步查阅文献及利用在线预测软件提示DNMTs可发生SUMO化修饰,IP结果显示DNMT3b SUMO1修饰程度在紫杉醇组明显升高。***染色提示DNMT3b与MMP-2在脊髓背角可共染。IP提示GA可降低DNMT3b SUMO化修饰程度。q PCR及WB显示GA可降低紫杉醇引起的MMP-2表达上调。进一步Ch IP实验显示紫杉醇组DNMT3b与MMP-2基因启动子结合程度降低,而GA可逆转这一改变,并且Me DIP实验显示GA可逆转MMP-2启动子甲基化程度的降低。研究结论紫杉醇可引起大鼠脊髓背角MMP-2表达增高而介导神经病理性疼痛。MMP-2表达增高的具体机制可能与DNMT3b SUMO化引起的其启动子区甲基化程度降低有关。本研究首次阐明了MMP-2在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用,并探索了其表达增高的具体机制,为更加深入认识CIPN的病理生理机制,探索新的治疗方法提供了新思路。