食源性金黄色葡萄球菌选择性培养基对肠毒素鉴定的影响

作     者：邱皓璞 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐幸莲

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：金黄色葡萄球菌 肠毒素 肠毒素基因型 兔血浆纤维蛋白原琼脂 葡萄球菌计数纸片 

摘      要：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起食物中毒最常见的一种致病菌,它可以通过各种途径和方式污染食品,摄入受该菌污染的食物会引起腹泻、呕吐等食物中毒症状。在日常检测工作中,先经过选择性培养基增菌,再通过凝固酶、耐热核酸酶生化评价进行形态学计数是金黄色葡萄球菌的常规检测方法。而金黄色葡萄球菌在其生长过程中产生的毒力因子众多,包括大量的侵蚀性酶类、溶血素、耐热核酸酶、外毒素等等,作为外毒素的一种,肠毒素才是引起食物中毒和人体过敏性休克最主要的致病源。目前对于常规计数方法与肠毒素产生量的相关性研究较少,而在实际检测工作中,仅仅进行食物中金黄色葡萄球菌菌株的检测已不能满足食品安全控制的要求,其肠毒素血清型的鉴别尤为重要。因此,为了探索并改进金黄色葡萄球菌的快速检测方法,实现对不同食源性金黄色葡萄球菌菌株的肠毒素血清型分型,本论文评估和比较了 Baird-Parker培养基基础（BP）、血浆纤维蛋白原琼脂（Rabbit Plasma Fibrinogen agar,RPFA）和 Petrifilm TM 葡萄球菌计数纸片（Petrifilm TM Staph Express count system,STX）这三种常用的食源性金黄色葡萄球菌计数方法和肠毒素产生之间的相关性。具体的研究内容和结果如下:1.食源性金黄色葡萄球菌的筛选根据国标法对市场上购置的肉制品、水产品、速冻食品、乳制品、生鲜肉等61份食品样品进行金黄色葡萄球菌检测,结果表明除饮料及蜂产品外,其他食品中均有金黄色葡萄球菌检出,共分离得到336株金黄色葡萄球菌。2.三种金黄色葡萄球菌选择性计数方法的比较将被金黄色葡萄球菌污染的食品样本粉碎均质后进行培养,稀释培养液后分别使用BP、RPFA及STX这三种形态学计数方法进行计数,结果表明通过这三种计数方法得到的食源性金黄色葡萄球菌的计数结果基本一致。3.选择性培养基对金黄色葡萄球菌肠毒素检测的影响随机选取上一章节选择性培养基上典型的金黄色葡萄球菌菌落进行培养,对其进行肠毒素的生化鉴定,将肠毒素阳性的克隆数除以检测得到的典型克隆总数,得出肠毒素阳性的金黄色葡萄球菌克隆比例,试验结果表明与传统的BP方法相比,STX和RPFA的形态学计数结果和肠毒素阳性计数之间的统计关联性更高。4.选择性培养基对金黄色葡萄球菌肠毒素血清型检测的影响设计了用于金黄色葡萄球菌11种肠毒素基因检测的SYBR GREEN荧光定量PCR引物。首先使用细菌基因组快速提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌菌株的基因组DNA,随后应用SYBR GREEN荧光定量PCR法对金黄色葡萄球菌肠毒素的血清型进行分型,比较三种选择性培养基对金黄色葡萄球菌肠毒素血清型检测的影响。试验结果表明:对于BP培养基,典型菌株中至少携带一种肠毒素基因的频率显著低于RPFA或STX,而RPFA上的典型菌落至少携带五种传统肠毒素基因（sea-see）之一的频率显著高于BP或STX。此外,尽管在三种培养基上,典型菌落携带至少一种肠毒素基因的比率存在显著差异,但是对于每一种单独的肠毒素血清型基因,其阳性比率在三种计数培养基上却没有显著性差异。