大豆钾转运蛋白基因GmHAK5的表达特征和功能研究
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈爱群
授予年度：2019年
摘 要：共生固氮就是微生物在与植物共生情况下,将空气中的分子态N2转化成植物可利用的化合态氮的过程。有研究表明,共生固氮的固氮量大约是全世界生物固氮量的65%,为农业系统供应了大量氮营养。钾是许多酶的激活剂、能增强光合作用、维持渗透压和平衡电势,因此被认为在共生固氮起重要作用。大多数土壤含K量为在0.1-1mM左右,并且由于局部耗竭以及土壤中的吸附作用,导致很多耕地土壤中有效K显著缺乏。因此,缺钾胁迫已经成为限制作物产量和品质的主要因素之一。植物根细胞对K+的吸收以及植物内的K+转运是由大量K+通道和转运蛋白进行的。钾转运体蛋白可以分为4个家族,即KUP/HAK/KT、HKT/Trk、CHX和KEA,其中,KUP/HAK/KT家族成员最多。在水稻和拟南芥中分别有27和13个KUP/HAK/KT基因。在拟南芥中,KUP1、KUP2、KUP4、KUP7及HAK5的功能已经得到了验证。大豆中,有32个KUP/HAK/KT基因,但到目前为止,关于该家族基因的报道少之又少,特别是对于可能参与共生固氮和根瘤发育的钾转运蛋白基因也还未知。因此,开展对大豆钾离子转运蛋白生理功能研究,对于揭示大豆根瘤K吸收和转运的生理和分子机制和培育钾高效利用的大豆新品种具有重大意义。在该研究中,大豆（Glycine max,cv.Williams-82）用于研究K营养对根瘤发育和固氮活性的影响。我们发现大豆KUP/HAK/KT家族中有一个基因GmHAK5编码高亲和K转运蛋白,且在根瘤中强烈表达。因此对该基因进行了详细的表达模式和功能分析。通过GmHAK5基因表达模式的研究、组织和亚细胞定位、异源系统的功能鉴定,以及通过下胚轴注射法转化大豆毛根获得该基因突变体材料和超表达材料与表型分析等一系列具体的分子和生理试验,获得主要研究结果如下:1.低氮（50μM）供应条件下,通过对不同浓度K+处理的接菌大豆分析发现,在提供适量的钾可以促进大豆植株生长,明显提高根瘤鲜重、大小和固氮酶活,显著增加大豆植株中N含量。特别是K+处理浓度为2mM时,地上部N含量增加了35.5%。然而不同浓度的K+处理对根瘤数目没有显著地影响。2.通过转录组数据分析发现了一个在根瘤中高量表达的属于HAK家族的钾转运蛋白基因GmHAK5。定量表达分析显示,该基因主要在根和根瘤中表达,茎中也有少量的表达,但花和叶中几乎不表达。接种根瘤菌的根中GmHAK5表达量较不接菌的高,且在接种根瘤菌4h时,表达量骤然上升,24h达到最大值,接着下降。GmHAK5在根瘤中的表达量受高钾诱导上调表达,且在接种根瘤菌20d时该基因达到最高。亚细胞定位结果显示GmHAK5是定位在细胞质膜的转运蛋白。组织定位结果表明该基因主要定位在根中柱中和根瘤的维管组织和皮层细胞中。GmHAK5能恢复K吸收缺陷型酵母突变体在0.5mM和1mM K+供应下的钾吸收能力。3.gmhak5突变株系根系和根瘤钾吸收量下降,显著抑制根瘤的生长和固氮能力。在低氮（50μM）供应条件下,gmhak5突变株系地上部的生物量明显降低,根系、地上部和根瘤中的钾含量也明显下降。与对照相比,gmhak5突变体地上部的K含量在接菌高钾（2mM K+）处理时降低了 27.9%,而在低钾（20μM K+）处理条件下无明显差异。与对照株系相比,gmhak5突变体根的钾含量在高钾和低钾处理时分别降低了26.6%、58.7%,在不接菌时与对照相比稍有下降。gmhak5突变株系根瘤K含量在高钾和低钾时分别降低了28.8%、35.5%。gmhak5突变株系根瘤数目、大小、鲜重以及固氮酶活受到极大地抑制。在正常钾处理时,突变体株系的根瘤数目、大小、鲜重以及固氮酶活与对照相比,分别降低了 28.2%、36.2%、50.8%、29.8%。而且gmhak5突变株系在高钾时的根瘤数目、大小、鲜重和固氮酶活与低钾时的无差异。在接菌时,gmhak5突变株系的地上部N含量与对照相比明显下降。特别是在高钾时,显著降低了 40.9%。低钾时降低了 23.6%。但这种差异只在接菌时存在,不接菌时并无明显差异。4.GmHAK5超表达株系明显促进了大豆植株的生长以及根和根瘤的K含量,表现出更好的结瘤能力。在低氮（50μM）高钾（2mM K+）情况下,接菌和不接菌时的超表达株系地上部K含量相较于对照株系分别增加了 52.1%和40.1%,而根中超表达株系总吸钾量分别增加了 50%和45.7%。在低钾（20μM K+）时,地上部和根中K含量虽也有增加,但差异不显著。GmHAK5过表达株系在正常钾时的根瘤鲜重、数目、固氮酶活相较于对照株系分别增加了 40.1%、22.7%、73.2%。GmHAK5过表达株系显著提高接菌大豆的N含量。特别是在正常钾时,地上部增加了 48.3%。根瘤中的N含量与对照株系相比高了 1.32倍左右。但这种N含量的差异只在接菌时存在,不接菌时并无明显差异。综上所述,K营养对大豆根瘤生长和固氮有很重要的作用。GmHAK5基因编码了一个高亲和力的钾转运蛋白,在根瘤中高量表达。它可能参与了根系和根瘤K的吸收,以及K从根系向根瘤运输过程,进而影响了根瘤生长发育和固氮作用。
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