琥珀酸脱氢酶抑制剂对小麦赤霉病菌DON毒素生物合成的调控机制研究

作     者：徐超 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周明国

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：小麦赤霉病菌 琥珀酸脱氢酶抑制剂 琥珀酸脱氢酶 DON 三羧酸循环 糖酵解途径 

摘      要：小麦赤霉病(Fusariumheadblight,FHB)是一种全球性的经济型病害,在我国其主要致病菌是禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和亚洲镰孢茵(Fusarium asiaticum)。赤霉病除了导致谷物的产量损失之外,禾谷镰孢菌在侵染的麦粒中还会产生一系列的有毒次生代谢物,其中以DON毒素为主。DON毒素不仅威胁着食用罹病谷物的人畜健康,同时还是一种重要的致病因子。目前防治小麦赤霉病,通常采用苯并咪唑类杀菌剂多菌灵等进行化学防治。然而,已知随着多菌灵的长期使用,不仅在生产上出现了抗药性病原群体,常常造成防治失败,而且多菌灵防治小麦赤霉病后,还会刺激DON毒素的生物合成,增加麦粒中DON毒素的污染。琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂(SDHIs,succinate dehydrogenase inhibitors)是一类呼吸作用抑制剂,其作用靶点是病原菌线粒体电子传递链上的琥珀酸脱氢酶复合物(复合物Ⅱ,SDH,succinatedehydrogenase)。SDHIs杀菌剂最明显的结构特征是其中都含有“酰胺基团。目前该类药剂被广泛用于防治水稻纹枯病、小麦锈病、小麦纹枯病和灰霉病等病害,其中萎锈灵作为SDHIs杀菌剂中最早的产品上市,在我国同时被登记用于小麦赤霉病的防治。目前先正达等企业正在登记新型琥珀酸脱氢酶抑制剂防治小麦赤霉病。因此,本研究选择了 SDHIs中的5种新型杀菌剂:氟酰胺、啶酰菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑和氟吡菌酰胺,探究它们对小麦赤霉病菌的抑菌活性及对DON毒素生物合成的调控作用。结果表明,上述5种SDHIs类新型杀菌剂除氟吡菌酰胺以外,在离体条件下对小麦赤霉病菌的菌丝生长均没有显著的的抑制作用,但对其孢子萌发的抑制效果较好,EC50值0.39-0.74 μg/mL。同时它们均能显著抑制小麦赤霉病菌DON毒素的生物合成和TRI5基因的表达。产毒小体是小麦赤霉病菌在产毒条件下形成的球形细胞器,经过这5种药剂处理后,产毒小体的球形结构被破坏,证明SDHIs杀菌剂可以抑制小麦赤霉病菌DON毒素的生物合成。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环和线粒体电子传递链的共同功能部分,为了从生理生化方面来探究SDHIs杀菌剂对DON毒素生物合成的调控机制,在药剂处理条件下测定了野生型敏感菌株2021中糖酵解途径关键基因的表达量、丙酮酸含量和乙酰辅酶A含量的影响,结果发现糖酵解途径关键基因己糖激酶和6-磷酸果糖激酶的表达被抑制,丙酮酸和乙酰辅酶A含量显著降低,揭示了 SDHIs杀菌剂通过抑制糖酵解关键基因表达,导致合成DON毒素的原料丙酮酸和乙酰辅酶A含量降低,从而抑制DON毒素生物合成的机制。此外,为研究糖酵解途径被抑制的原因,测定了药剂处理2021菌株后琥珀酸脱氢酶(SDH)和异柠檬脱氢酶(ICDHm)活性及柠檬酸的含量的变化,发现SDH和ICDHm的活性都降低,导柠檬酸含量增加。ICDHm是三羧酸循环的限速酶,该酶活性下降会减慢三羧酸循环速率。柠檬酸含量上升,则可能反馈抑制糖酵解途径。同时,我们还发现5种SDHIs杀菌剂处理2021菌株后,ATP含量显著下降,进一步说明SDHIs杀菌剂通过抑制糖酵解和三羧循环能够有效抑制小麦赤霉病菌的能量合成。为进一步探究小麦赤霉病菌中琥珀酸脱氢酶是否参与DON毒素合成的调控,选取了 2021菌株琥珀酸脱氢酶两个C亚基的敲除体(ΔFGSG1981和ΔFGSG9012)为研究对象,测定了琥珀酸脱氢酶C亚基敲除对DON毒素产量、TRI5基因表达量及丙酮酸含量的影响,结果表明,琥珀酸脱氢酶两个C亚基调控着小麦赤霉病病菌DON毒素及丙酮酸的生物合成。另外琥珀酸脱氢酶C亚基敲除后,无法形成正常产毒小体结构,说明小麦赤霉病菌中琥珀酸脱氢酶参与了 DON毒素合成的调控。综上所述,SDHIs杀菌剂通过抑制SDH,干扰三羧酸循环和糖酵解途径,使合成DON毒素的前体物质减少,从而有效抑制小麦赤霉病菌中DON毒素的生物合成。此外,小麦赤霉病菌中琥珀酸脱氢酶参与调控了 DON毒素的生物合成。