西来稗(Echinochloa crus-galli ***)生长激素受体基因克隆及其蛋白表达

作     者：贾兆星 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李俊

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：西来稗 二氯喹啉酸 EczAFB2/EczAFB3 真核蛋白表达 SF9细胞 

摘      要：西来稗是水稻田恶性杂草之一,近年来其抗药性的现象逐渐愈加显著。西来稗对二氯喹啉酸的抗药性机理问题需要亟待解决。目前,关于西来稗对二氯喹啉酸的抗药性机理研究主要集中于植物生长激素生物学途径受激素型除草剂二氯喹啉酸干扰后的下游激素响应反应,而植物生长激素生物途径中上游激素动态平衡、激素信号感知、信号转导与二氯喹啉酸抗药性关系的研究很少,至于二氯喹啉酸如何影响西来稗生长激素途径仍未有研究报道。已有报道,通过拟南芥突变体实验证明,AFBs蛋白突变体植物会表现出不同程度的生长素响应缺陷。而生长素结合实验表明,AFBs家族蛋白是生长素结合所必需的。故而,推测AFB家族也很可能是生长激素的受体。本研究以抗二氯喹啉酸西来稗(Echinochloa crus-gallivan zelayensis)为对象,推测西来稗体内的生长激素受体可能与西来稗对二氯喹啉酸抗药性有关。具体来说,抗性西来稗生物型体内 AFBs家族蛋白突变可能导致其对激素型除草剂二氯喹啉酸响应延迟或者停顿现象,进而导致其信号传导受阻,最终植物表现出抗药性的表型,设想西来稗抗药性现象是否类似于模式植物拟南芥中AFBs蛋白突变体导致植物出现不同程度的生长素响应缺陷,还需进一步探索验证。本文通过基因克隆得到西来稗AFB2和AFB3基因全长序列,并对该基因进行生物信息学分析:EczAFB2基因开放阅读框为1728bp,可翻译575个氨基酸,理论等电点(pI):7.05,分子量为64.47kD,该基因所编码的氨基酸序列与已知的模式植物水稻的OsAFB2基因相比,相似性为84%;EczAFB3基因开放阅读框为1722bp,可翻译573个氨基酸,理论等电点(pI):8.94,分子量为64.65kD,该基因所编码的氨基酸序列与已知的植物玉米的ZmAFB3基因相比,相似性为63%。通过基因保守性基序分析,EczAFB2和EczAFB3均有三个典型的保守基序分别为Motif1、Motif2、Motif3,而通过该基因的敏感性和抗性生物型可知:EczAFB2基因的第一个保守基序Motif 1(从起始密码子算起)的56位亮氨酸(Leu)突变为缬氨酸(Val);保守基序Motif 2区间无突变;而在保守基序Motif 3区间的451位的谷氨酰胺酸(Gln)突变为赖氨酸(Lys)和452位的组氨酸(His)突变为谷氨酰胺酸(Gln);而EczAFB3基因在保守基序区间均无突变。通过对EczAFB2和EczAFB3基因进行结构分析和蛋白亚细胞定位预测可知,都具有典型的F-box结构域和重复LRRs功能域,确定其定位于细胞核并具有生长激素信号识别的功能。通过蛋白质三级结构预测可知,EczAFB2和EczAFB3基因所编码的蛋白均为signaling protein,以模式植物拟南芥AtTIR1三级结构模型的相似度(identify)为基准作为参考,结果显示西来稗EczAFB2的相似度为61.70%,水稻OsAFB2的相似度为62.23%,拟南芥AtAFB2的相似度为61.59%;而西来稗EczAFB3的相似度为55.44%,玉米ZmAFB3的相似度为60.04%,拟南芥AtAFB3的相似度为60.35%。为进一步验证提出的假想,我们建立了西来稗的EczAFB2基因的真核蛋白表达体系。采用真核蛋白表达体系中的昆虫细胞杆状病毒表达系统,对西来稗的EczAFB2基因进行杆状病毒表达载体构建,成功在昆虫细胞SF9里表达出高水平的EczAFB2蛋白。结果显示,表达出的目的蛋白大小约为64KDa,与理论预测结果相符合。为体外进行蛋白与小分子互作的方式以明确激素型除草剂二氯喹啉酸在西来稗体内的靶标受体,并进一步揭示二氯喹啉酸抗药性是否与激素受体相关奠定了技术基础。