转录因子FoxO3a在慢性创面中的表达及其对人角质形成细胞再上皮化的作用及机制研究
作者单位：中国人民解放军陆军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：樊东力
授予年度：2020年
主 题：FoxO3a 增殖与迁移 上皮间质转化 角质形成细胞 再上皮化 慢性创面
摘 要：研究背景:皮肤是人体最大的器官,其作为环境保护屏障,承担着感觉、吸收、分泌、排泄和保护等重要的生理功能,参与体内多种代谢过程,维持内环境的稳定。因此,皮肤完整性一经破损就需要立刻修复以恢复其功能。而基于烧伤、烫伤、血管病变引发的皮肤溃疡、压疮、糖尿病溃疡足等由于内、外在因素作用下而引起的大面积皮肤完整性缺损,创面发生病理性炎症反应,不能通过正常的修复程序实现愈合,进而导致愈合缓慢或不愈,引起患者严重伤残或死亡,同时给患者家庭带来沉重的经济负担。因而,寻找针对慢性创面的诊断和治疗靶点,是该领域亟待解决的关键科学问题。创面修复涉及一系列复杂的事件,包括炎症、角质细胞迁移、增殖、肉芽组织形成和基质重塑等诸多生理过程,这些事件与转录因子（愈合过程中的关键分子）、效应基因及其蛋白质产物（包括细胞因子IL-1,IL-6）、生长因子（TGF、EGF、KGF、PDGF、FGF）、蛋白水解酶及其抑制剂（即基质金属蛋白酶MMPS/TIMPS）和细胞外基质成分（胶原,透明质酸）等密切相关。尽管在过去的几年中,一些效应基因及其蛋白产物已经被鉴定出来,但对皮肤创面愈合过程的转录调控的了解却少之又少。转录因子是创伤反应中微调基因表达的关键分子,通过促进或抑制下游靶基因转录,进而调控创面边缘角质形成细胞再上皮化,影响创面愈合。转录因子FoxO3a（Forkhead box O3a）基因定位于人染色体6q21上,编码673个氨基酸,其转录活性受磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化等多种翻译后修饰作用所调节。FoxO3a在人体内分布广泛,在皮肤角质形成细胞及成纤维细胞中均有表达,与细胞衰老密切相关,随着年龄的增长,皮肤中FoxO3a的表达逐渐增加。既往文献报道,FoxO3a是一个参与多种细胞关键信号通路的重要转录因子,通过与其它转录因子的相互作用,整合不同信号参与内环境稳定的调控,在细胞、组织与胚胎的发育、卵泡的成熟、葡萄糖内稳态、细胞增殖与凋亡、DNA的损伤修复等过程中发挥着重要作用。在肿瘤发生过程中,FoxO3a作为抑癌基因,通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖及控制肿瘤细胞分化、抑制血管生成、调节其它抑癌基因表达而发挥抑癌作用,上调FoxO3a表达,可显著抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。在前列腺癌细胞中,FoxO3a通过介导经典Wnt信号通路,靶向调控β-catenin蛋白表达,负向调控细胞上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）进程。然而,FoxO3a在创面再上皮化中是否对角质形成细胞EMT同样发挥类似的调控作用,进而影响创面愈合,目前尚未见报道。在创伤修复领域,有学者通过对正常的皮肤组织与愈伤组织进行转录因子芯片筛查分析显示,与正常的皮肤组织相比,皮肤愈伤组织中的转录因子FoxO1、FoxO4、FoxO3a和FoxO6均发生不同程度表达的下调,其中FoxO3a表达差异较显著。因此,为了探索FoxO3a在创面愈合过程中发挥的功能及作用机制,在本研究中,通过临床取材,在人体组织水平分析急、慢性创面组织中的FoxO3a表达水平的变化及分布,评价FoxO3a对慢性创面发生、发展的意义;在细胞水平,观察过表达或干扰FoxO3a基因后对细胞的增殖与迁移能力的影响,通过构建体外细胞模型并对其可能机制进行研究,为慢性创面的治疗提供新的切入点。此外,在临床上通过对2009年1月至2016年12月收治在我院整形美容外科的慢性创面患者进行回顾性分析和调查,分析慢性创面患者创面的特点以及采取的相关治疗措施,以期为慢性创面的预防和治疗提供有用信息。方法:一、FoxO3a蛋白在人急性创面和慢性创面组织中的表达及分布1.通过临床取材,分别收集人慢性创面（伤后至少4周）和急性创面（伤后一周内）组织标本,分别采用Real-time PCR和Western blot,在分子水平定量分析FoxO3a的表达差异。2.采用免疫组织染色技术分析FoxO3a在急慢性创面组织中的表达和分布,评价FoxO3a对慢性创面发生、发展的意义。二、FoxO3a在人角质形成细胞Ha Ca T细胞中的功能研究1.设计、合成靶向沉默FoxO3a的3条si RNA,并筛选最佳干扰效果的si RNA,通过脂质体转染入人角质形成细胞Ha Ca T中,分别采用Real-time PCR和Western blot观察FoxO3a在转录水平和蛋白水平的干扰效率。2.构建人FoxO3a基因重组慢性病毒颗粒Lenti-Flag-FoxO3a并感染人角质形成细胞Ha Ca T,分别采用Real-time PCR和Western blot检测FoxO3a在m RNA和蛋白水平的过表达效率。3.CCK8法分析干扰或过表达FoxO3a基因后对Ha Ca T细胞增殖能力的影响。4.体外划痕实验检测干扰或过表达FoxO3a基因后对Ha Ca T细胞迁移能力的影响。5.通过Real-time PCR和Western blot分别检测干扰FoxO3a基因表达后金属基质蛋白酶MMP-1、MMP-9和金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-1 m RNA与蛋白水平表达变化。6.通过Real-time PCR和Western blot分别检测过表达FoxO3a基因后MMP-1、MMP-9和TIMP-1 m RNA与蛋白水平表达变化。三、FoxO3a促进角质形成细胞启动再上皮化进程机制研究1.通过转化生长因子TGF-β1诱导Ha Ca T细胞构建体外EMT细胞模型,采用Western blot检测上皮细胞标志物E-cadherin,间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin以及FoxO3a蛋白表达的影响。2.通过转染FoxO3a-si RNA下调Ha Ca T细胞中FoxO3a表达后,并采用Western blot观察E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。3.通过感染Lenti-Flag-FoxO3a慢病毒颗粒,分别采用Western blot和免疫细胞荧光技术检测上调Ha Ca T细胞中FoxO3a表达后,对TGF-β1诱导前后EMT标志物E-cadherin和Vimentin表达的影响。4.通过转染FoxO3a-si RNA下调Ha Ca T细胞中FoxO3a表达后,分别提取各组Ha Ca T细胞浆与细胞核蛋白,采用Western blot分析β-catenin蛋白的表达变化。5.通过感染Lenti-Flag-FoxO3a慢病毒颗粒上调Ha Ca T细胞中FoxO3a表达后,分别提取各组Ha Ca T细胞浆与细胞核蛋白,采用Western blot分析β-catenin蛋白的表达变化。四、慢性创面住院患者临床特点调查与分析1.通过收集我院整形美容外科2009年1月至2016年12月的住院患者共计154例慢性创面患者相关资料,包括年龄、性别、职业、城乡分布、创面部位、形成原因、治疗方式、平均住院日进行回顾性调查和分析,以列表的方式进行描述,部分数据采用方差分析或卡方检验统计分析。结果:一、FoxO3a蛋白在慢性创面组织中表达增加。1.与急性创面相比,慢性创面组织中FoxO3a在m RNA和蛋白水平表达明显增高。2.在慢性创面组织细胞中,FoxO3a主要分布在细胞核中。二、在人慢性创面组织中高表达的FoxO3a蛋白抑制角质形成细胞增殖与迁移。1.FoxO3a蛋白表达下调可明显促进角质形成细胞Ha Ca T的增殖和迁移能力。2.过表达FoxO3a蛋白可显著抑制角质形成细胞Ha Ca T的增殖和迁移能力。3.在Ha Ca T细胞中,FoxO3a蛋白表达下调可增强MMP-1和MMP-9、抑制TIMP-1蛋白表达;而当过表达FoxO3a后,MMP-1和MMP-9蛋白表达明显降低,TIMP-1蛋白表达明显增加。三、在人慢性创面组织中高表达的FoxO3a蛋白负性调控角质形成细胞再上皮化。1.转化生长因子TGF-β1诱导的体外Ha Ca T细胞EMT模型成功建立。2.在TGF-β1诱导的体外Ha Ca T细胞EMT模型中FoxO3a表达明显减少。3.沉默FoxO3a表达促进Ha Ca T细胞EMT进程。4.过表达FoxO3a抑制TGF-β1诱导的Ha Ca T细胞EMT进程。5.沉默FoxO3a表达后Ha Ca T细胞浆和细胞核中β-catenin含量增加。6.过表达FoxO3a后Ha Ca T细胞浆和细胞核中β-catenin含量减少。四、慢性创面住院患者的主要临床特点。1.在本次调查中,慢性创面患者高发年龄段为61～70岁,占总患病人数的24.7%。2.从事体力劳动的患病人数远多于其他职业,占总患病人数的61.7%;且男女比为1.56:1。3.慢性创面以下肢为多发部位,占患病总人数的47.4%,其中创伤性慢性创面患者占64.9%,男女比1.85:1。4.采用清创+负压治愈的慢性创面患者占患病总人数的56.5%。结论:1.与急性创面相比,慢性创面组织中FoxO3a表达增加,高表达的FoxO3a负性调控β-catenin表达及核转位参与调控角质形成细胞EMT,进而抑制细胞迁移,阻碍角质形成细胞再上皮化,影响创面的正常愈合。2.我院整形美容外科2009年1月至2016年12月的住院患者共计154例慢性创面患者中,不同年龄段、不同职业在慢性创面的性别分布、患病部位上有所差异,以农村、男性、体力劳动的患者居多,61～70岁年龄段为易感阶段,下肢部位最为多发;此外,负压引流技术是一种促进慢性创面愈合,缩短患者平均住院时长的有效治疗手段。
同方学位论文库