玉米螟表皮蛋白OfCPT1和OfCPT2的表达纯化及性质研究

作     者：蒋望 

作者单位：大连理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨青

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：昆虫表皮 表皮蛋白 几丁质结合 液液相分离 壳聚糖膜 

摘      要：亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是我国玉米等农作物的主要害虫,对亚洲玉米螟表皮的研究能为进一步了解玉米螟表皮形成机制以及如何维持表皮生理结构提供帮助。几丁质和表皮蛋白作为两种主要成分共同构成昆虫表皮,因此,对两者相互作用的探讨在研究昆虫表皮的形成机理具有重要意义。CPT家族蛋白一类重要的昆虫表皮蛋白,其缺失可能造成表皮结构不完整。氨基酸序列分析发现亚洲玉米螟OfCPT1和OfCPT2属于CPT家族表皮蛋白,具有CPT家族保守结构域,可能具有与几丁质结合的能力。本论文探究了OfCPT1和OfCPT2的理化性质及其与几丁质的相互作用,得到以下研究结果:1)基于亚洲玉米螟转录组数据调出Ofcpt1和Ofcpt2基因序列,在NCBI数据库中对氨基酸序列进行查找,获得OfCPT1、OfCPT2氨基酸序列。对序列进行分析,OfCPT1、OfCPT2蛋白分别在N端有一段19个和14个氨基酸的信号肽序列。序列的多重比对显示OfCPT1、OfCPT2均含有一段100个氨基酸的保守序列,均位于蛋白序列中间。两个蛋白均属于亲水蛋白,且等电点接近。2)本研究利用pET-28a载体在原核表达系统中实现了OfCPT1蛋白的包涵体形式表达,通过镍离子螯合层析纯化,经过复性得到OfCPT1蛋白,最终收率为50 mg/L。利用pET-28a载体在原核表达系统中实现了OfCPT2蛋白的可溶形式表达,通过镍离子螯合层析纯化,最终收率为5 mg/L。3)几丁质结合实验表明,OfCPT1具有选择性结合几丁质的能力。Of CPT1对α-几丁质、β-几丁质、壳聚糖、胶体几丁质和几丁质纳米微晶均有较弱的结合能力,而与几丁质纳米微丝结合能力更强。4)通过分析圆二色光谱研究壳聚糖结合对蛋白二级结构的影响,结果表明,OfCPT1结合壳聚糖溶液后结构发生了变化,蛋白的二级结构从结合壳聚糖前的以α-螺旋（61.2%）为主,变为结合后以β-折叠（87.8%）为主。OfCPT1通过改变自身二级结构的方式从而有利于与壳聚糖的结合。5)通过拉伸法测定蛋白-壳聚糖复合膜机械性能,结果表明Of CPT1在1%浓度的条件下能有效改善复合膜的延伸率和韧性。6)显微镜观察结果表明,OfCPT1在溶液中存在NaCl的条件下蛋白会发生液液相分离。OfCPT1 N端含有一段固有无序序列,可能是导致该蛋白产生液液相分离原因。通过动态光散射测定液滴粒径,结果表明产生液滴大小和密度既与NaCl浓度有关也与溶液pH有关。本文揭示了亚洲玉米螟CPT家族表皮蛋白的几丁质结合性质以及与壳聚糖结合后的蛋白质二级结构的改变,探究了OfCPT1对表皮形成的影响和壳聚糖膜的改性作用,并发现OfCPT1蛋白具有液液相分离的性质。以上研究结果有助于深化人们对于CPT家族蛋白的认识,为揭示昆虫表皮形成机制奠定了基础。