重组腺病毒疫苗临床前稳定性和有效性评价

作     者：郭杰 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张海红

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：肿瘤疫苗 疫苗稳定性 疫苗有效性 

摘      要：癌症难以在早期发现且极难治愈,是全球中致死率最高的非传染性疾病。近年来,由于癌症发病率和死亡率的不断提升及高额的医疗负担得到广泛重视。癌症的治疗方法多样,其中肿瘤疫苗作为继手术和放化疗之后的生物疗法成为研究的重点。目前,肿瘤疫苗作为一种新的治疗手段在我国临床上已经取得较为显著的研究成果,主要通过刺激机体产生的特异性针对肿瘤的免疫应答起到抑制或治疗肿瘤的作用。它采用的载体形式多样,其中腺病毒载体由于其安全性高、易制备等特点得到广泛应用。本论文使用的重组腺病毒疫苗是以人5型腺病毒为载体,融合表达MUC1和survivin两种肿瘤相关抗原基因进行构建。腺病毒在人体中广泛存在,经改造后的腺病毒载体在体内不能进行复制,因此安全性较高。并且MUC1和survivin两种基因在肿瘤细胞中表达与正常细胞存在差异,所以机体能够特异性地对肿瘤细胞产生免疫反应。为评价疫苗的稳定性,首先对western blot、酶切、PCR三种疫苗检验方法从专属性和耐用性两方面进行方法学建立,确定了疫苗稳定性检测时的实验条件。随后以此实验条件,对重组腺病毒疫苗AD-MS的病毒库、遗传稳定性、三批中试样品及其加速稳定性、长期稳定性等几方面进行检测。结果表明,病毒库样品基因组完整且能够表达外源基因。病毒库经传代后,在25代以内均能够保证其稳定性,在生产和研究过程中将25代作为该疫苗的传代标准。随后对中试生产的三个批次疫苗样品进行鉴别实验,三批样品均符合理论结果。三批样品的加速稳定性和长期稳定性结果显示,疫苗在37℃放置超过3天、25℃超过1个月时需要进行进一步评价;在4℃、-20℃、-80℃下贮存时间可达12个月或以上。随后采用小鼠对AD-MS进行免疫免疫效果的评价。为了对猴体及临床试验提供参考,在小鼠水平对中试生产的AD-MS免疫剂量及免疫间隔进行免疫原性检测。结果表明,随着AD-MS剂量的增加,疫苗诱导的抗原特异性T淋巴细胞产生IFN-γ的能力增强,并且在免疫8×10VP/只时能够达到与阳性对照水平相当的免疫效果。与单独一次免疫相比,多次免疫能够引起更强的免疫效果,三次免疫与两次免疫相比脾细胞产生IFN-γ的能力增强但效果并不显著。免疫后的小鼠脾细胞经MUC1和survivin两种蛋白刺激均能够产生特异性免疫反应,针对survivin蛋白引起的免疫反应更强,其中能够针对至少一种蛋白产生阳性反应的小鼠占88.46%。利用小鼠肺癌模型对AD-MS抑制肿瘤生长效果进行检测,与PBS组相比AD-MS能够抑制肿瘤生长。当AD-MS与化药吉西他滨和顺铂联合使用时,有更显著的抑制肿瘤生长效果。