不同刚度三维肿瘤脱细胞支架对乳腺肿瘤细胞耐药性的影响

作     者：王洪军 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕永钢

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺肿瘤细胞 脱细胞 细胞外基质 刚度 耐药性 

摘      要：乳腺癌是女性发病率最高的恶性癌症,虽然早期诊断和治疗的不断完善已经明显降低了乳腺癌的死亡率,但是仍有部分患者最终会发生转移和复发。导致乳腺癌患者生存期缩短和术后复发的原因之一是乳腺肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。肿瘤细胞对化疗药物的抗性可能是由多种因素引起的,其中肿瘤微环境起着重要作用。在肿瘤三维(three dimensional,3D)微环境中,细胞增殖、耐药性以及恶性表型与基质刚度相关。因此,制备一种适宜刚度的3D肿瘤体外培养模型对于研究乳腺肿瘤细胞耐药性具有重要意义。相比其他3D肿瘤体外培养模型,肿瘤脱细胞基质(decellularized extracellular matrix,DECM)保留了原生肿瘤组织的成分和结构,能更好地模拟体内肿瘤微环境。本实验室前期已经成功构建了表达不同丰度赖氨酰氧化酶(extracellular matrix-modifying enzyme lysyl oxidase,LOX)的乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231,然后利用该细胞表达不同水平的LOX对肿瘤组织的ECM进行不同程度的共价交联,从而成功制备了低(0.74±0.10 kPa)、中(1.6±0.14 kPa)、高(2.0±0.19 kPa)三种不同刚度的肿瘤DECM支架(Φ10 mm×2.0 mm),并证实了该支架可以维持MDA-MB-231细胞的粘附和生长,然而该支架对肿瘤细胞的迁移、耐药等恶性表型的影响仍不清楚。为此,本文进一步探究了不同基质刚度3D肿瘤DECM支架对MDA-MB-231细胞耐药性的影响。其主要研究内容和结果如下:(1)不同刚度脱细胞支架对乳腺肿瘤细胞耐药性的研究通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、激光共聚焦显微镜3D重建功能以及DNA定量检测等方法检测支架的再细胞化表现,其结果表明:MDA-MB-231细胞可浸润到支架内部,相比中刚度组和高刚度组,低刚度组更能促进细胞的浸润。DNA定量结果显示三组支架的细胞接种效率和再细胞化10天的细胞量统计均无显著性差异。通过MTS法和流式细胞术对顺铂(cisplatin,DDP)药物处理后的细胞活性、凋亡以及周期进行检测,其结果表明:20?M DDP药物处理后,相比二维(two dimensional,2D)培养,在DECM支架上培养的肿瘤细胞活性更强,凋亡的细胞数量更少,且高刚度组中的细胞增殖能力和活性显著高于低刚度组,而高刚度组中的细胞凋亡量为11.98±2.95%,显著低于低刚度组(40.35±3.62%)。通过qPCR和Western blot分别检测再细胞化支架中肿瘤细胞耐药相关基因和蛋白的表达,其结果表明:相比低刚度组和中刚度组,高刚度组更能促进MDA-MB-231细胞B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以及三磷酸腺苷结合盒转运子B亚家族成员1(ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1)基因和蛋白表达。(2)ABCB1在3D不同基质刚度影响乳腺肿瘤细胞耐药性中的作用通过Western blot检测elacridar处理不同刚度DECM上MDA-MB-231细胞后ABCB1蛋白的表达,其结果表明:elacridar处理可以显著性下调不同刚度DECM支架上细胞的ABCB1蛋白表达水平,并且各组之间ABCB1蛋白表达没有显著性差异。通过MTS法和流式细胞术对elacridar和DDP药物处理后细胞的活性、凋亡以及周期进行检测,其结果表明:当加入elacridar后,各组之间IC50值都有一定程度的降低,并且各组之间IC50值没有显著性差异。Elacridar作用后,高刚度组中的细胞增殖能力显著下降,而细胞凋亡率则从11.98±2.95%提高至48.89±5.48%。综上所述,本文从细胞水平证实了3D基质刚度可以影响乳腺肿瘤细胞的耐药性,高刚度(2.0±0.19 kPa)3D肿瘤DECM支架中MDA-MB-231细胞表现出对常用化疗治疗药物DDP的高耐药性,该现象可能与ABCB1对DDP诱导的细胞凋亡的抑制性有关。因此,本文研究结果可为后续的3D培养提供一定理论依据,同时为肿瘤的药物筛选、血管新生以及上皮间质转化的研究提供一种新的研究工具。