Penetratin衍生短肽RR9对口腔链球菌抗菌作用的初步探究

作     者：杨艳艳 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王永兰

授予年度：2020年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：细胞穿透肽 RR9 口腔链球菌 牙龈成纤维细胞 细胞毒性 口腔生物膜 

摘      要：目的:本研究旨在评价一段衍生短肽对口腔初期附着菌的抗菌活性及其作用机理以及其生物相容性,获得一种有效控制生物膜形成的抗菌策略。口腔生物膜是由多种微生物形成的复杂的微生态系统,其在多种口腔疾病中起到重要的作用。而生物膜形成初期链球菌属的附着,作为生物膜形成的基础,影响生物膜的结构和性质,干扰初期附着菌可以有效控制生物膜的形成。口腔链球菌如口链球菌(Streptococcus oralis,***)、血链球菌(Streptococcus sanguinis,***)和格登链球菌(Streptococcus gordonii,***)是牙菌斑形成的初期附着菌,细胞穿透肽Penetratin是一类具有细胞穿透及抗菌特性的多功能肽,本研究通过合成Penetratin衍生短肽RR9(Arg-Gln-Ile-Arg-Arg-Trp-Trp-Gln-Arg-NH),以探究其对口腔链球菌的抗菌作用及机制。并通过检测短肽RR9对人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts,HGFs)的增殖能力的影响,了解细胞的生物学活性,以此来评价RR9的生物相容性。方法:用蛋白质分析软件初步预测及使用圆二色光谱(Circular Dichrosim,CD)验证RR9的结构性质。通过体外抑菌实验检测最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)、最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC)及时间致死曲线,来评价短肽RR9对浮游状态下口腔初期附着菌***,***,***的生物活性。采用结晶紫定量法(生物膜易感性实验)和激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)两种方法测定RR9对口腔链球菌生物膜形成的作用。同时通过扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察了口腔初期附着菌的细胞形态变化,并用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)实验探究其抗菌机理。采用体外细胞培养技术,CCK-8和AO/EB荧光染色实验研究RR9对人牙龈成纤维细胞的毒性作用,评价其生物相容性。结果:软件预测及CD结果显示Penetratin衍生短肽RR9是非结构性短肽,MIC、MBC和生物膜易感性实验结果显示RR9对***,***,***明显的抗菌活性,且对三种口腔链球菌的抗菌活性无明显差异(P0.05)。时间致死曲线表明,随着RR9干预时间的延长,细菌存活数量在4小时后明显下降,并在48小时内几乎达到100%杀灭。荧光染色CLSM结果显示RR9处理组中红色的死菌数量明显增多,而SEM和TEM显示RR9处理组的细菌形态相较于对照组有明显变化。RR9使***中的基因ssp A的表达下调。CCK-8及荧光染色实验结果显示RR9处理组的细胞增殖量与空白对照组相比无明显差异,即RR9对HGFs未见明显的细胞毒性。结论:短肽RR9对口腔初期附着菌***,***,***具有较强的抗菌及抗生物膜形成的作用,对人牙龈成纤维细胞无明显或低细胞毒性,说明短肽RR9在口腔疾病中具有潜在的临床应用价值,Penetratin衍生的肽是开发新型抗菌药物的有效模板。