海南芒果可可球二孢对多菌灵抗性机制的研究

作     者：曾耿狄 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨叶

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：芒果 可可球二孢 多菌灵 β-微管蛋白基因 抗性机制 

摘      要：芒果（Mangfera indica L.）是热带地区重要的经济作物,海南省是我国芒果的主产区。苯并咪唑类杀菌剂由于作用位点单一的特点,加上这类药在海南施用频率高很容易产生抗药性。在前期研究基础上选取3株MBC-S、4株MBC-MR和5株MBC-HR芒果可可球二孢分别进行菌株抗性的遗传稳定性、对温度的敏感性、高渗溶液的敏感、菌丝电导率及相关酶活性检测,旨在探讨菌株可能的抗性特性及抗性生化机制。克隆并分析比对抗感多菌灵芒果可可球二孢菌株的β-微管蛋白基因序列;及β-微管蛋白基因表达量与多菌灵敏感性的关系,探讨抗药性产生的分子机制;根据MBC-HR和MBC-MR菌株中β-微管蛋白基因第198位和200位的密码子的点突变,根据ASO-PCR法设计了 PCR引物LYT-R/LYT-Z和YT-R1/YT-Z1尝试芒果可可球二孢对多菌灵的抗性快速检测技术。研究结果表明:1.12株抗感多菌灵芒果可可球二孢的抗性可以稳定遗传,高温及低温均会抑制菌株的生长,抗性菌株存在低温敏感性。12株抗感多菌灵可可球二孢菌株菌丝的生长随着葡萄糖和NaCl的浓度增加先促进后抑制,MBC-S敏感菌株高盐环境比MBC-HR和MBC-MR菌株更敏感。2.12株抗感多菌灵芒果可可球二孢的相对电导率呈现一个先上升后趋于平缓的趋势。50 mg/L的多菌灵药剂处理后,敏感菌株的相对电导率明显提高且始终大于抗性菌株,也说明敏感菌株对多菌灵敏感,受药剂的破坏细胞内物质渗漏严重。测定抗感多菌灵芒果可可球二孢菌丝中甘油的含量,结果表明抗感菌株菌丝中甘油含量没有差异。3.可可球二孢抗、感多菌灵菌株的菌丝内的CAT酶活性存在明显差异,抗性菌株中的酶活性较高;高抗菌株CAT酶活性约是敏感菌株的4倍。抗性菌株中的GST酶的活性也比敏感菌高;抗感菌株的POD酶活性没有显著性差异。4.通过克隆抗感多菌灵可可球二孢菌株的β-微管蛋白的基因序列的比对分析,发现MBC-HR高抗菌株第198氨基酸的密码子谷氨酸（GAG（Glu））突变为丙氨酸GCG（Ala）,发生碱基突变,MBC-MR中抗菌株第200位氨基酸密码子200位TTC（Phe）变为酪氨酸TAC（Tyr）。β-微管蛋白基因序列的cDNA全长行447个氨基酸,MBC-HR高抗菌株β-微管蛋白的基因相对表达量大于MBC-MR中抗菌株大于MBC-S敏感菌株。***-PCR法设计了 PCR引物LYT-R/LYT-Z能使MBC-MR中抗菌株扩增出700 bp左右的条带,其他菌株不能不增出来。而YT-R1/YT-Z1能使MBC-HR高抗菌株扩增出700 bp左右的条带,其他菌株不能不增出来。结论:芒果蒂腐病菌可可球二孢对多菌灵产生抗药性的田间菌株β-微管蛋白基因发生点突变、抗性菌株具有稳定性及高适合度,抗性风险高。除了基因突变,菌株在细胞膜透性及酶活性均与抗性产生机制的有关。