载脂蛋白apoA-I模拟肽L-4F治疗胰腺癌的作用机制研究

作     者：黄文敬 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张荣信

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：L-4F 胰腺癌 炎症 STAT3 MAPK 

摘      要：背景:胰腺癌是一种侵袭性的恶性肿瘤,传统的放疗和化疗常常难以奏效,因此开发新的治疗策略(比如免疫治疗)就显得十分重要。载脂蛋白apo A-I(apolipoprotein A-I)是高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的主要蛋白成分,约占该蛋白质含量的75%左右。许多研究证明载脂蛋白apo A-I具有抗氧化、抗炎等功能。载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F是根据Apo A-I的生物功能保守区域,开发设计的具有双亲性的模拟肽,它由18个氨基酸组成,但保留了Apo A-I的基本功能活性。之前的研究已经证实载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F是一个有效的抗炎剂。研究目标:将载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F应用于胰腺癌研究中,通过体内外实验全面探讨其可能的抗肿瘤作用及其机制。研究方法与内容:在体内试验中,胰腺原位接种小鼠胰腺癌细胞系H7细胞至C57BL/6小鼠,以构建小鼠原位胰腺癌模型。荷瘤小鼠被随机分为两组,然后分别每天接受腹腔注射载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F及其无功能对照Sc-4F治疗。在体外试验中:我们利用小鼠巨噬细胞RAW 264.7,经脂多糖(LPS)刺激,构建体外炎症反应模型;同时,小鼠胰腺癌细胞系H7细胞用不同浓度的载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F处理后,检测细胞的侵袭能力,细胞增殖能力和细胞凋亡率。脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F的抗瘤作用通过检测肿瘤的生长曲线,肿瘤体积和肿瘤重量来评估;脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F的免疫调节作用应用流式细胞仪法检测小鼠脾脏、肿瘤浸润细胞的各免疫细胞亚群的比例的变化来评估,包括分泌IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-4、GM-CSF、IL-1β的细胞及Th细胞亚群;采用提取总RNA,从m RNA水平分析肿瘤组织中炎症因子IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-4、GM-CSF、IL-1β表达。体外研究中,采用小鼠巨噬细胞RAW 264.7构建的体外炎症模型,通过酶联免疫法及免疫印记杂交分析细胞上清液中炎症因子IFN-γ、IL-6,及STAT3与MAPK信号途径,探讨载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F对炎症因子的表达分泌影响及相关的分子机制;采用胰腺癌H7细胞,通过划痕实验、增殖与凋亡检测等实验方法,探讨载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F对小鼠胰腺癌细胞直接的细胞毒性。结果:1)、体内实验中,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F对于胰腺癌具有一定的抗肿瘤作用。与对照Sc-4F治疗组相比,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F治疗后,小鼠胰腺原位癌模型中的肿瘤体积和肿瘤重量均明显降低;组织石蜡切片的HE染色显示,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F处理抑制了肿瘤组织中的血管生成与炎症细胞浸润。2)、载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F可通过调节胰腺癌的免疫微环境,发挥抗肿瘤作用。与对照Sc-4F治疗组相比,L-4F治疗组的H7细胞肿瘤组织中的IL-17A、IL-4、IFN-γ、IL-6、GM-CSF与IL-1β分泌细胞明显减少;肿瘤组织中炎症因子IL-17A、IFN-γ、IL-6与IL-1β的m RNA水平显著下调;CD4/IL-17A细胞亚群(即Th17细胞)、CD4/IFN-γ细胞亚群(即Th1细胞)的数量明显减少,达到了统计上的显著差异水平以上。3)、载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F抗肿瘤作用与影响免疫细胞的炎症因子表达与分泌有关。我们应用小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞,通过LPS刺激构建体外炎症反应实验,研究载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F的抗炎作用。我们发现:小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞,经LPS刺激后,与空白对照处理组相比,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F处理降低了LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症因子TNF-α与IL-6的表达分泌,且其行为具有一定浓度依赖性。4)、载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F通过促进STAT3信号途径、抑制MAPK信号而发挥抗炎作用。小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞,经LPS刺激后,与空白对照处理组相比,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F处理促进小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中STAT3的磷酸化水平;与此同时,小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞中MAPK信号途径组分JNK与p38的磷酸化水平,受到载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F抑制。5)、载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F不能直接作用于小鼠胰腺癌H7细胞,发挥抗肿瘤作用。与空白对照处理组相比,载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F处理不能影响该肿瘤细胞的迁徙能力、增殖,也不能诱导该细胞的凋亡事件发生。结论:1)、载脂蛋白apo A-I模拟肽L-4F对于胰腺癌具有一定的抗肿瘤作用。载脂蛋白apo