红棕象甲幼虫体外挥发物对金龟子绿僵菌的抑菌效能及其有效成分分析
作者单位：福建农林大学
学位级别：硕士
导师姓名：侯有明
授予年度：2020年
摘 要：昆虫在自然环境中生存与繁殖,不仅要有充足的取食环境,还需要克服自然界中影响其生存的各种不良因素的干扰。当遇到病原微生物等外来因素的胁迫时,昆虫会启动自身的免疫防御机制来进行防御。其中,体外免疫作为免疫防御策略中的一种,形成第一道屏障,利用表皮和化学防御物质将病原物阻挡在体外。体外分泌物作为体外免疫的主要方式,由多种成分混合而成,从昆虫的各类腺体分泌到体外发挥其特殊的作用。而体外挥发物也可以作为体外防御的一种方式,释放到环境当中,不仅可以起到信息素的作用,还可以抑制微生物的生长。昆虫个体在不同龄期及不同性别时所释放的挥发物成分与排放量都存在着区别,继而其发挥的抑菌效果也有所差异。红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus Olivier作为我国林业检疫性有害生物,入侵我国后严重危害棕榈科植物,给这些观赏性和经济植物带来了巨大的经济损失。而其为害部位的隐蔽性和自身固有的防御机制,为该虫的防治带来了一定的困难。为了更加有效地利用生物防治方法控制红棕象甲的为害,本文研究了红棕象甲的体外挥发物对病原菌的影响,明确挥发物的主要成分,探索其抵抗病原菌的活性物质等。本文主要运用顶空法收集红棕象甲幼虫的体外挥发物,使用孢子萌发率测定法进行抑菌活性的测定。并且采用金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae对幼虫进行免疫刺激后进行抑菌活性的测定,据此明确病原胁迫对红棕象甲幼虫体外挥发物抑菌能力的影响。并采用固相微萃取结合气质联用仪的方法,测定体外挥发物的主要成分。测定不同龄期幼虫体外挥发物的抑菌效果与组成成分,初步鉴定挥发物的成分及量与抑菌作用的联系。并通过胁迫前后的挥发物对比与抑菌作用的变化,筛选出导致抑菌作用产生变化的成分,即挥发物中可以起到抑菌作用的活性物质。再使用单个成分验证对病原菌的抑菌效果,明确成分的抗菌活性等。得出了以下的主要结果:1.红棕象甲幼虫的体外挥发物对金龟子绿僵菌的抑菌效果:我们通过3头、5头和7头不同虫量的体外挥发物抑菌实验的测定可知,虫量的增加加强了挥发物的抑菌效果。同时通过分别在处理后8 h和12 h两个时间点测定幼虫体外挥发物对1×10～6个孢子/m L和1×10～7个孢子/m L两个不同浓度的金龟子绿僵菌的抑菌效能,发现孢子浓度的增加不影响其抑菌效果。2.金龟子绿僵菌胁迫前后红棕象甲幼虫挥发物的抑菌效果:使用金龟子绿僵菌菌液胁迫24 h后,发现幼虫体外挥发物仍有抑菌作用,但与胁迫前比较,孢子萌发率有显著的增高。在使挥发物作用于金龟子绿僵菌12 h的时候,相比较于胁迫前,孢子萌发率增加6%。而在20 h的时候,孢子萌发率增加64%。由此可知,经过胁迫处理后的红棕象甲幼虫体外挥发物的抑菌能力变弱。3.不同龄期的红棕象甲幼虫挥发物对金龟子绿僵菌的抑菌效果:通过红棕象甲5龄、7龄、9龄和11龄幼虫挥发物的测定中发现,其释放的挥发物的量随着龄期的增长而增加,而9龄与11龄老熟幼虫则没有显著的差异。再通过对这四个不同龄期的幼虫挥发物进行了抑菌实验,发现它们对金龟子绿僵菌均有抑菌效果,并且其效果也随着龄期的增长而增加,而其中9龄与11龄老熟幼虫的抑菌能力最高,且两组无显著差异。由此可知,虫体体外挥发物的释放量是影响抑菌能力的一大重要因素。4.红棕象甲幼虫体外挥发物的组成成分与有效抑菌成分:经过对挥发物的成分测定,发现红棕象甲幼虫体外挥发物主要由醇类、酚类、醌类、醛类、酸类、萜类、酮类、酯类、烷烃类、吡啶类和芳香烃化合物组成。其中,己醛、正壬醇、二苯甲酮、2-苯乙醇和4-乙基愈创木酚等成分对金龟子绿僵菌具有抑菌效能。从上述结果可知,体外挥发物作为红棕象甲防御性物质的一种,对金龟子绿僵菌具有抑菌作用。其中测得以上五种成分,可以对金龟子绿僵菌的起到抑制作用,是影响体外挥发物抑菌效能的重要因素。而这些挥发物的成分也随着龄期产生变化,并对抑菌能力产生一定的影响。从而可知,红棕象甲体外挥发物作为一种防御物质,在体外可以起到一定的抑菌作用。然而对于这些挥发物的来源与对其他菌群的作用还尚不明确,有待进一步的研究。
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