miR-21-5p通过DUSP8调控P38/MAPK通路介导多柔比星诱导的三阴乳腺癌凋亡的研究

作     者：谭琦 

作者单位：锦州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈素贤

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：miR-21-5p DUSP8 P38/MAPK 三阴性乳腺癌 生物信息学 

摘      要：目的通过癌症公共数据库对三阴乳腺癌中参与调控的重要miRNAs进行分析筛选,之后通过生物信息学对差异表达的miRNAs与其靶基因的生物学功能进行预测。探讨人三阴乳腺癌关键miRNAs（miR-21-5p）对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,并进一步探讨多柔比星对三阴乳腺癌的治疗作用与P38/MAPK通路有关,且这种关联是通过miR-21-5p调控DUSP8来完成的。方法（1）利用TCGA、GEO数据库及差异miRNAs筛选和GO、KEGG通路富集分析筛选乳腺癌与癌旁组织中差异表达的miRNAs,确定候选miRNA及靶基因。（2）MTT检测ADM对MDA-MB-231细胞生存率的影响,选取ADM的最佳作用浓度。（3）PCR检测ADM处理后MDA-MB-231细胞中miR-21-5p基因表达水平;检测miR-21-5p mimics转染效率,确定最佳转染时间。（4）细胞划痕实验观察ADM、ADM+SB203580及过表达/沉默miR-21-5p对MDA-MB-231细胞迁移与伤口愈合的影响。（5）Hoechst33258实验观察ADM、ADM+SB203580及过表达/沉默miR-21-5p对MDA-MB-231细胞凋亡的形态学变化。（6）流式细胞术检测ADM、ADM+SB203580及过表达/沉默miR-21-5p对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。（7）Western blot检测ADM、ADM+SB203580及过表达/沉默miR-21-5p对MDA-MB-231细胞中DUSP8、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P38、P-P38蛋白表达水平。结果一、基因的筛选及验证1.利用TCGA数据库发现:乳腺癌组织中的miR-21-5p表达水平明显高于癌旁组织（log FC=5.557,P0.01）;GEO数据库筛选得到:miR-21-5p在TNBC细胞系中表达水平明显升高,TNBC患者化疗后miR-21-5p的表达水平明显降低（log FC=-5.07,P0.01）;KEGG通路富集与targetscan分析得出:DUSP8作为miR-21-5p的靶基因通过p38丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）通路影响TNBC的发生发展。2.MTT实验发现,ADM作用MDA-MB-231细胞后,细胞存活率随给药浓度的增加而降低,当浓度为10μmol/L时,细胞存活率为55.762%,趋于50%,故ADM的最佳实验浓度为10μmol/L。3.ADM处理细胞后,细胞中miR-21-5p基因表达水平显著下降（P0.001）,DUSP8表达水平显著升高（P0.001）。二、ADM通过P38-MAPK途径诱导MDA-MB-231细胞凋亡1.细胞划痕实验发现,ADM和ADM联合P38-MAPK通路抑制剂（ADM+SB203580）组干预MDA-MB-231细胞24、48h后,细胞迁移速度及修复能力均明显降低。划痕面积分别为:71.83%、67.75%和91.37%、84.46%;以联合作用组对MDA-MB-231迁移影响最强。2.Hoechst 33258实验观察发现,ADM和ADM+SB203580组作用后,细胞核均出现不同程度的碎片高亮,表明细胞存在凋亡状态。3.流式细胞术发现,ADM和ADM+SB203580均能促进MDA-MB-231细胞凋亡,凋亡率分别为36.40%和40.23%,又以ADM+SB203580组促凋亡效果最强（P0.05）。4.ADM和ADM+SB203580干预后,MDA-MB-231细胞中p-p38、Pro ca spase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P0.001）,DUSP8、Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高（P0.001）,以ADM+SB203580组作用最强（P0.05）。三、miR-21-5p通过DUSP8-P38/MAPK通路影响MDA-MB-231细胞凋亡1.MDA-MB-231细胞转染miR-21-5p mimics与inhibitor后,24h转染效率最高。2.转染miR-21-5p mimics与inhibitor 24h后,miR-21-5p mimics组细胞迁移速度和修复能力增强（P0.05）,miR-21-5p inhibitor组细胞迁移能力显著降低（P0.001）。3.转染24h后,miR-21-5p inhibitor组细胞凋亡率为36.14%,与正常组相比显著升高（P0.001）,miR-21-5p mimics组细胞凋亡率与正常组相比差异无统计学意义（P0.05）4.转染24h后,miR-21-5p mimics组p-p38、Pro Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达水平显著提高,DUSP8、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达水平显著降低（P0.001）,miR-21-5p inhibitor各蛋白表达水平与mimic s组相反。结论1.miR-21-5p作为癌基因影响TNBC的发生发展过程。2.ADM通过抑制miR-21-5p的表达,进而激活DUSP8表达,进一步影响P38/MAPK及凋亡相关蛋白的表达,最终促进了MDA-MB-231的凋亡。