黄芪甲苷调控VEGF/PI3K/AKT信号通路干预肺微血管内皮细胞血管新生的影响及临床研究

作     者：王璐 

作者单位：山东中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张伟

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：间质性肺疾病 血管新生 黄芪 黄芪甲苷 VEGF信号通路 

摘      要：目的:间质性肺疾病（interstitial lung disease,ILD）是以间质增生、炎症细胞浸润为主要病理改变的一组异质性疾病,肺间质纤维化（pulmonaryfibrosis,PF）是间质性肺疾病中最常见的类型,在中医学中,其多归于“肺痿范畴,病程一般呈进行性发展,目前尚无确切有效的临床治疗药物。研究发现,血管新生及修复在肺纤维化疾病中发挥了重要作用,VEGF/PI3K/AKT信号通路为血管新生机制相关的重要通路之一。中药单体黄芪甲苷是黄芪中生物活性最高的一种单体化合物,黄芪为中医临床治疗肺纤维化的常用药物之一。临床研究通过对山东省中医院肺病科门诊用于治疗间质性肺疾病的相关方剂、中药进行整理归类,分析常用药物规律;实验研究则以黄芪甲苷为实验药物,在大鼠肺微血管内皮细胞诱导损伤后,给予黄芪甲苷干预,观察黄芪甲苷调控VEGF/PI3K/AKT信号通路对大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）血管新生的作用,以期为临床治疗提供参考及依据。方法:1.临床研究:整理2016年1月～2017年12月山东省中医院肺病科治疗间质性肺疾病的门诊病历资料,从中选择符合本次研究纳入标准病例316例,处方316首,运用EXCEL软件,建立数据库,对处方中药物的使用频次及用药规律进行相关分析。同时选取临床典型病案进行病例分析。2.实验研究:2.1大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）诱导损伤模型的建立及黄芪甲苷的浓度的选择。应用CCK-8法选取不同浓度的诱导剂IL6及黄芪甲苷作用于的大鼠PMVECs,选取实验药物浓度;2.2基于VEGF/PI3K/AKT信号通路观察血管新生及黄芪甲苷对于IL6诱导损伤的大鼠PMVECs的影响。分为空白对照组（A组）、模型组（B组）、黄芪甲苷+PMVECs+IL6组（C组）、VEGF抑制剂组+PMVECs+IL6（D组）四组,除空白对照以外,以上每组细胞先用IL-6实验浓度处理12h,然后加入不同药物处理24h。此后,观测细胞增殖及细胞凋亡情况,同时Western blot法检测各组VEGF、PI3K、AKT、mTOR蛋白水平并比较,qPCR测定各组VEGF的mRNA水平并比较。结果:1.临床研究:通过对临床316例病例处方用药进行分析,最常用的中药种类有补气药、活血化瘀药、清热化痰类药物。使用频次最高者为黄芪,其次还有麻黄、前胡、白前、枇杷叶等。典型病案分析中,运用扶正益气法治疗的间质性肺疾病患者,患者自诉相关呼吸道症状较前缓解,因感染加重次数亦较前减少。2.实验研究:根据CCK-8结果,将诱导剂IL-6的浓度（1μg/mL）定为干预浓度,黄芪甲苷浓度（10μM）定为实验浓度。IL-6干预大鼠PMVECs后,与A组相比,IL-6抑制了细胞的增殖,VEGFmRNA蛋白水平下降,PI3K等相关因子蛋白表达水平亦降低。VGEF抑制剂作用后可降低细胞的增殖,下调表达VEGF mRNA,并使VEGF等因子蛋白水平降低;与A组、B组相比,C组可以促进细胞的增殖,提高VEGF mRNA蛋白水平,PI3K等相关因子蛋白表达水平亦提高。结论:（1）该院肺病科门诊在应用中药治疗间质性肺疾病时,黄芪的应用频率高,导师张伟教授治疗间质性肺疾病时,辨证论治,重视补益气血,亦多应用黄芪配伍治疗,同时兼顾止咳化痰、活血化瘀,临床有一定效果,对指导临床用药具有重要意义。（2）IL-6可以抑制大鼠PMVECs细胞增殖,从而对细胞造成损伤,黄芪甲苷能够促进大鼠PMVECs细胞的增殖,提高VEGF及PI3K等相关因子的蛋白表达,考虑其可能通过VEGF/PI3K/AKT通路发挥作用,促进血管新生。